两品种猕猴桃果实采后淀粉降解特性比较分析

柴吉钏 刘 璐 陈景丹 王 康 曹士锋 施丽愉 杨震峰 陈 伟

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波 315100)

猕猴桃(Actinidia chinesis)是典型的呼吸跃变型果实，跃变一旦发生，其果肉硬度、颜色、细胞壁、营养物质和芳香物质均会发生明显变化[1]。商业上猕猴桃主要有中华猕猴桃(A. chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)2 个品种[2]。不同品种的猕猴桃之间存在差异[3]，中华猕猴桃包括Hort 16A、Sanuki Gold、Kohi 等，该品种猕猴桃果肉呈黄色，果实可溶性固形物含量高、有机酸浓度低[4]；而美味猕猴桃Hayward 果实体积大、果肉呈绿色。两品种猕猴桃中，中华猕猴桃更易产生乙烯[5]，即中华猕猴桃果实的贮藏期和货架期均短于美味猕猴桃[6]。

猕猴桃果实在成熟过程中碳水化合物含量的增加主要归因于淀粉的累积。而果实是植物贮藏淀粉的重要器官之一，未成熟的香蕉、猕猴桃、苹果等果实中均含有大量淀粉[7－8]。Richardson 等[9]将猕猴桃果实成熟发育过程分为细胞分裂期、淀粉积累期和果实成熟期3 个阶段。果实在细胞分裂期结束后开始积累淀粉，进入成熟期后淀粉开始降解，直至果实完全成熟，淀粉几乎完全转变为可溶性糖[9]。王贵禧等[10]研究发现，采后猕猴桃果实的快速软化主要是由于淀粉酶活性的上升加快了淀粉的降解速度。

淀粉降解由多种酶共同作用完成，起始于淀粉粒表面发生的可逆葡聚糖磷酸化[11－12]。淀粉粒在葡聚糖水合双激酶(glucan water dikinase，GWD)和磷酸化葡聚糖水合双激酶(phosphoglucan water dikinase，PWD)的作用下磷酸化[13]，使淀粉粒结构松散，有利于水解酶分解糖链，但水解酶不能隔着磷酸基团降解糖苷键，因此需要去磷酸酶( phosphoglucan phosphatase)释放磷酸[14－15]，使水解酶彻底降解糖链，同时形成一个磷酸循环[16]。拟南芥中存在2 种去分支 酶(dranching enzyme，DBE)，包括异淀粉酶(isoamylase，ISA) 和极限糊精酶(limit dextrinase，LDA)，它们都是支链淀粉彻底降解所必需的酶[17]。松散淀粉粒在ISA3 的作用下生成可溶性线性葡聚糖，再在β－淀粉酶(β-amylase，BAM)的催化下水解生成残缺的麦芽三糖和麦芽糖[14，17－18]，也可以在葡聚糖磷酸化酶(α-glucanglucan phospholylase，PHS)和歧化酶(disproportionating enzyme，DPE)作用下进一步形成葡萄糖－1－磷酸和葡萄糖。相比于BAM，α－淀粉酶(αamylase，AMY)对于暂时的淀粉降解作用并不显著，但AMY3 可独立于GWD 和PWD，直接作用于非水溶性淀粉粒，可将淀粉内部的α－1，4 共价键进行切割，释放出的分支葡聚糖在ISA3 和(或)LDA 的作用下通过脱支反应得到线性葡聚糖，使得淀粉粒的降解变得相对简单[19]。

目前果实淀粉降解相关酶基因的研究只有在番茄、香蕉、猕猴桃等水果中有少量报道[20]，且尚未建立明确的遗传背景。为此，本试验以红阳和翠玉猕猴桃果实为试验材料，探讨不同品种猕猴桃果实成熟软化与淀粉降解的关系，研究其内在的联系，以期为淀粉降解与成熟软化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

猕猴桃果实采自浙江省宁波市东钱湖猕猴桃种植基地，分别摘取形状匀称、大小均一、处于商业成熟(可溶性固形物含量为5.5%～6.0%，硬度为35～40 N)且未受病虫害的红阳(HY)和翠玉(CY)2 个品种猕猴桃果实，在果实采摘后1 h 内运至实验室。随机将猕猴桃果实分为3 组，每组至少60 个，试验重复3次。随后置于恒温恒湿箱(温度25℃，湿度95%)中贮存12 d，每2 d 进行1 次取样。果实去皮后，去头去尾，沿头尾方向切开，选用与切开面中心对称的果肉，快速放入液氮，待其完全冻结后，快速磨成粉，混合均匀后装入离心管，存放于－80℃超低温冰箱中备用。

RNA 提取试剂盒、DNaseI，美国Omega Bio-Tek 公司；SuperRT cDNA 第一链合成试剂盒，江苏康为世纪生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

TMS-Touch 物性分析仪，美国FTC 公司；2014C 型气相色谱仪，日本岛津；NanoDro-p2000 核酸蛋白分析仪，美国Thermo Fisher Scientific；凝胶成像仪，美国BIO-RAD；JEOL JFC－1600 离子溅射仪、JEOL JSM－6460 LV 扫描电镜，日本JEOL。

1.3 试验方法

1.3.1 果实硬度 结合质地剖面分析法(texture profde analysis，TPA)通过TMS-Touch 物性分析仪对猕猴桃果肉进行硬度测试。测试参数设置如下:测试速度30 mm·min－1，果肉受压变性15%，触发力0.1 N(传感器量程为25 N 时)或1 N(传感器量程为1 000 N时)。试验选用直径为7.5 mm 的圆柱形探头。每次随机选取5 个果实，沿赤道部位进行2 次硬度测定。

1.3.2 乙烯释放速率测定 选择2.5 L 的密闭容器作为乙烯释放速率测定专用容器。从贮藏样品中随机选择5 个果实放入专用容器中，迅速盖紧盒盖，同时放入原贮藏环境中，2 h 以后运用气相色谱仪对容器中的乙烯释放量进行测定，测定过程以标准乙烯气体作为对照，计算桃果实乙烯释放速率，结果以μL·kg－1·h－1FW 表示。本试验选用Rtx－5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色谱柱，选用高纯度N2作为载气，其他相关测定参数为:柱温80℃，检测器(FID)温度270℃，进样口温度230℃，进样量1 mL。

1.3.3 淀粉粒提取及扫描电镜观察 参考聂丹[21]的方法提取猕猴桃外果肉和果心淀粉。称取液氮研磨后的果肉25 g，放置于100 mL 1 g·mL－1的亚硫酸氢钠溶液中浸泡过夜。次日使用100 目标准筛过滤浆液，将过滤所得淀粉悬浊液4 000 r·min－1离心20 min，沉淀即为淀粉沉淀。使用超纯水再次清洗淀粉沉淀，离心(4 000 r·min－1，20 min)取沉淀，重复3 次，获得纯度更高的淀粉沉淀。将所获得的淀粉沉淀倒入氢氧化钠溶液(0.002 g·mL－1)中混匀，静置4 h。静置完成后，离心(4 000 r·min－1，20 min)取沉淀即为淀粉。将获得的淀粉放入去离子水中继续清洗，离心去沉淀，重复3次，而后将所获得的淀粉放入无水乙醇中继续清洗，直至无色，然后用去离子水清洗沉淀直到无乙醇气味。最后使用200 目标准筛过滤悬浊液，离心(4 000 r·min－1、 20 min)弃上清液取沉淀，置于烘箱中，45℃烘干过夜。

金属镀膜:参考萧允艺[20]的金属镀膜法，即采用特殊装置JEOL JFC－1600 离子溅射仪将电阻率小的铂金粉蒸发后覆盖在样品表面。样品表面镀上一层金属膜可以有效抵御电子束的伤害，使二次电子产生率显著增加，所获得的图像质量更佳，同时充电、放电效应也得到有效抑制。

扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)观察:参数为20 kV，真空条件下，放大倍数分别为2 000倍、5 000 倍和10 000 倍。

1.3.4 淀粉含量测定 参考苗红霞等[22]的方法。将2 g 的果肉样品放入5 mL 80%乙醇中，并用匀浆机混匀，离心(4 000×g，15 min)取沉淀，接着倒入5 mL 去离子水充分清洗，再次离心(4 000×g，15 min)取沉淀，将沉淀放入5 mL 80% Ca(NO3)2溶液中继续溶解，然后通过沸水浴加热溶液10 min，离心(4 000×g，4 min)取沉淀，所获取的沉淀通过80% Ca(NO3)2溶液提取2 次。然后将上清液混合并定容至20 mL。在100 μL 0.01 mol·L－1I2-KI 溶液中加入2 mL 上清液混匀，测定600 nm 波长处的吸光度值，重复3 次。用淀粉标准液制定标准曲线，通过标准曲线计算样品猕猴桃果实的淀粉含量(标准曲线的绘制使用淀粉标准液)，淀粉含量结果以mg·g－1FW 表示。

1.3.5 猕猴桃果实RNA 的提取及cDNA 的合成 参考邵佳蓉等[23]的方法，略有调整。两品种猕猴桃果实的总RNA 提取使用植物RNA 提取试剂盒，具体过程参照说明书。试验过程中加入DNaseI 从而排除总RNA 中可能的微量DNA 污染，防止对后续cDNA 合成过程造成影响。使用核酸蛋白分析仪对样品RNA 浓度和纯度进行测定。通过凝胶成像仪观察提取RNA条带的完整性、大小和清晰度。按照SuperRT cDNA第一链合成试剂盒说明书进行cDNA 合成。

1.3.6 实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测 本试验模板为从猕猴桃基因组数据库中(http:/ /bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)获得的各基因全长序列，相关引物通过Primer 6 软件设计，引物如表1 所示。qRT-PCR 利用荧光定量引物进行3 步法扩增。qRT-PCR 程序:95℃预变性7 min；95℃变性15 s，45℃退火30 s，75℃延伸15 s，39 个循环。内参引物为Actin基因(引物见表1，退火温度为63℃)，设置阴性对照。采用2－ΔΔCT方法对最终的数据进行分析，设置3 次生物学重复。

表1 试验所需引物Table 1 Primers required for the experiment

1.4 数据分析与统计

试验数据采用GraphPad Prism 5 软件绘图，结果以平均值±标准偏差表示。采用非配对T 检验进行显著性分析，采用Pearson 进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果实采后硬度的变化

由图1 可知，果实的硬度是指果肉抗压能力的强弱，可直观地反映出果实的成熟软化。两品种猕猴桃果实在成熟过程中硬度均呈下降趋势，在贮藏后期(4～12 d)CY 猕猴桃果实的硬度极显著高于HY 果实。

2.2 猕猴桃果实采后乙烯释放速率的变化

由图2 可知，在果实贮藏过程中，CY 猕猴桃果实的乙烯释放速率保持在较低的水平，基本没有乙烯释放。HY 猕猴桃果实在贮藏前期与CY 果实无显著性差异，贮藏10 d 时其乙烯释放量急剧增加，且极显著高于CY 果实(P<0.001)。

2.3 猕猴桃果实采后淀粉形态变化

由图3 可知，在刚采摘的猕猴桃果肉中，淀粉粒表面光滑，在果实成熟软化过程中，两品种猕猴桃果实的淀粉颗粒均有不同程度的消化和破碎，这是淀粉降解的痕迹，且CY 猕猴桃果实的淀粉降解缓于HY 果实。

2.4 猕猴桃果实采后淀粉含量的变化

由图4 可知，在猕猴桃果实贮藏期间，其外果肉和果心的淀粉含量均呈下降趋势，HY 猕猴桃外果肉中淀粉含量在贮藏前期(0～2 d)极显著高于CY 外果肉(P<0.01)，但在贮藏后期(8～12 d)极显著低于CY 外果肉(P<0.001)；HY 猕猴桃果心中淀粉含量在贮藏2～4 d 与CY 果实无显著差异，但在贮藏后期(6～12 d)极显著低于CY 果心(P<0.001)。表明HY 猕猴桃果实淀粉含量下降速率快于CY 猕猴桃果实。

2.5 猕猴桃果实采后淀粉降解酶基因表达变化

由图5 可知，在整个猕猴桃果实贮藏期间，猕猴桃外果肉中AcGWD、AcPWD和AcLSF1 的表达量呈下降趋势，且CY 猕猴桃外果肉和果心中AcGWD的相对表达量均极显著高于HY 猕猴桃(P<0.001)；在AcPWD表达量下降过程(4～12 d)中，除贮藏10 d 时CY 猕猴桃外果肉和果心的相对表达量极显著高于HY 猕猴桃(P<0.01)，其他贮藏时间两品种猕猴桃无显著差异；贮藏前期AcLSF1 的相对表达量表现为HY 猕猴桃外果肉(0～4 d)和果心(0 d)显著或极显著高于CY 猕猴桃；0 d 时AcLSF1 在HY 猕猴桃果心中的表达极显著高于CY 猕猴桃(P<0.01)。两品种猕猴桃果心中AcGWD、AcPWD和AcLSF1 的表达趋势与果肉基本一致。

由图6 可知，CY 猕猴桃外果肉AcISA3 的相对表达量在贮藏10～12 d 时显著高于HY 果实(P<0.01)；果心中的AcISA3 表达量在贮藏前期(0～6 d)略有上升，后期(10～12 d)急剧下降。贮藏期间，外果肉中AcLDA1 的相对表达量呈先上升后略下降的趋势，在贮藏前期(2～6 d)HY 猕猴桃中的表达量极显著高于CY猕猴桃，在贮藏后期(8～12 d)无显著差异；在果心中，AcLDA1 的相对表达量与外果肉存在差异，且在贮藏前期(2～6 d)CY 猕猴桃的AcLDA1 相对表达量显著或极显著高于HY 猕猴桃。

由图7 可知，两品种猕猴桃外果肉中AcAMY1 相对表达量在贮藏前期呈上升的趋势之后呈波动变化，HY 猕猴桃中AcAMY1 的相对表达量达到峰值早于CY猕猴桃；且在果心的变化趋势与外果肉相似，但CY 猕猴桃在贮藏4～12 d 过程中果心AcAMY1 的相对表达量极显著高于HY 猕猴桃。AcAMY3 的相对表达量在贮藏2～8 d 时先急剧下降后又上升，且在不同品种呈相同趋势。

由图8 可知，猕猴桃外果肉与果心中AcBAM1 的相对表达量在贮藏0～2 d 时迅速增加，贮藏后期(6～12 d)缓慢上升，且贮藏10～12 d 时HY 猕猴桃外果肉和果心的相对表达量显著或极显著高于CY 猕猴桃。贮藏期间，两品种猕猴桃外果肉和果心AcBAM3 的相对表达量呈上升趋势，且与乙烯释放趋势一致，贮藏后期(8～12 d)基因相对表达量急剧增加，且HY 猕猴桃外果肉AcBAM3 的相对表达量极显著高于CY 外果肉，两品种猕猴桃果心中AcBAM3 的表达与外果肉结果基本一致。

由图9 可知，在贮藏期间，两品种猕猴桃外果肉中AcDPE1 和AcDPE2 的相对表达量在贮藏2 d 时上升随后下降，后期又呈上升趋势，且HY 猕猴桃外果肉表达量均显著或极显著高于CY 猕猴桃；果心中AcDPE1 和AcDPE2 表达量随贮藏时间总体呈上升趋势，但两品种间均无显著差异(P>0.05)。果心和外果肉中AcPHS1的相对表达量均随着贮藏时间的延长呈下降趋势，贮藏前期(2～4 d)HY 猕猴桃外果肉中AcPHS1 的相对表达量极显著高于CY 猕猴桃，而在贮藏后期(10～12 d)极显著低于CY 外果肉。

3 讨论

已有研究表明，不同品种(或品系)猕猴桃采收期和采后生理变化(尤其是采后果实的呼吸作用、乙烯代谢及果实软化等生理变化)与果实耐贮性和贮藏品质密切相关[24－26]。本研究发现，随着贮藏时间的延长，两品种猕猴挑果实的硬度及淀粉含量均呈下降趋势，硬度的变化与淀粉含量变化较一致；同时在乙烯发生跃变时，淀粉含量快速下降，HY 猕猴桃果实淀粉含量的下降速率快于CY 果实，且果心中淀粉含量的下降速率慢于外果肉；HY 果实释放乙烯速率急剧上升时，CY 果实一直保持在低水平。这表明HY 猕猴桃果实出现呼吸跃变早于CY 果实。

果实成熟过程中产生大量内源乙烯。内源乙烯对果实多糖水解、香味物质产生、硬度下降等一系列生理变化具有调控作用[27]。乙烯是果实尤其是跃变型果实成熟衰老进程中的关键因子。乙烯释放量可以反映猕猴桃果实的成熟衰老进程。已有研究报道，在桃果实贮藏期间，当果实硬度快速下降时，果实内源乙烯含量出现跃变高峰[28]。黄森等[29]研究发现，柿子内源乙烯与果实硬度呈显著相关。本研究发现，HY 猕猴桃果实硬度迅速下降并伴随乙烯跃变，而CY 猕猴桃果实硬度缓慢下降未出现乙烯释放高峰。HY 果实中乙烯的释放与硬度呈显著负相关(r＝－0.898，P<0.01)。

成熟前，果实内大量的淀粉是果肉保持硬度的重要因素。淀粉对细胞起支撑作用，可维持组织整体膨压，因此，果实采后成熟软化与淀粉的降解有关。研究发现，在苹果果实发育过程中，β－淀粉酶和α－淀粉酶活性由低到高，与淀粉含量呈现互为消长的变化，推测它们参与了果实质体中淀粉的降解[30]。魏建梅等[31]对香蕉的研究发现，MAmy、Maisa、Ma-bmy等基因参与采后淀粉降解；也有研究发现，β－淀粉酶活性的明显增强在香蕉果实淀粉降解中起关键作用[32－33]。本研究发现，在两个品种猕猴桃中，AcAMY1 和AcAMY3 表达量在淀粉降解前期增加，表明AcAMY1 和AcAMY3 在淀粉降解前期起作用。Hu 等[34]研究表明，猕猴桃AdBAM3.1/3L/9 与淀粉降解呈显著正相关，证实该基因可能参与淀粉降解过程。也有研究发现在猕猴桃叶片中稳定过表达AdBAM3L能有效降低叶片淀粉含量，说明该基因可能是猕猴桃淀粉降解的关键酶基因[35]。本研究中，AcBAM1 和AcBAM3 基因的相对表达量随着淀粉降解在贮藏后期呈上升趋势，且在HY 猕猴桃外果肉中的表达均比CY 高，尤其AcBAM3 相对变达量明显增强，说明AcBAM1 和AcBAM3 基因在HY 猕猴桃果实的淀粉降解过程中发挥了重要作用，且AcBAM3 基因的作用更为关键。已有研究表明，DPE 涉及了淀粉代谢相关酶的磷酸化过程。本研究中，AcDPE1 和AcDPE2 在HY 猕猴桃外果肉中的相对表达量均显著或极显著高于CY，表明AcDPE1 和AcDPE2 基因是HY猕猴桃果实淀粉降解的关键基因。这与陈景丹等[36]的研究结果一致。Xiao 等[37]研究发现，MaPHS基因参与了香蕉果实的淀粉降解。PHS 活性主要受该基因表达水平的影响，该酶在淀粉代谢过程中发挥重要作用。本研究结果表明，贮藏前期HY 果实AcPHS1 基因表达量总体高于CY 果实，这可能导致HY 淀粉降解速度更快。植物中淀粉磷酸化是可逆的，由两种类型的磷酸化酶催化，分别是葡聚糖水合双激酶(添加磷酸基)和磷酸葡聚糖磷酸酶(去除磷酸基团)，并且这2 种酶可以促进或维持葡聚糖水解[38]。本研究还发现随着淀粉降解，AcGWD、AcPWD、AcLSF1 在贮藏期间2 个品种猕猴桃外果肉和果心中的表达量均呈下降趋势，可能与淀粉含量有关。另外，本试验中AcDPE1、AcDPE2、AcGWD、AcPWD和AcLSF1 基因的相对表达量随贮藏时间变化的结果，与香蕉[37]中的结果相反，这可能是不同品种果实淀粉代谢存在差异所导致的。

4 结论

本研究结果表明，HY 猕猴桃果实成熟软化快于CY 果实。随着贮藏期的延长，HY 猕猴桃果实硬度迅速下降并伴随出现乙烯跃变，CY 果实硬度缓慢下降且未出现乙烯释放高峰。在两品种猕猴桃中，AcAMY1 和AcAMY3 在淀粉降解前期起作用，AcBAM1、AcBAM3、AcDPE1 和AcDPE2 在淀粉降解中可能起重要作用，尤其是AcBAM3 可能起关键作用。另外，AcBAM1、AcBAM3、AcDPE1、AcDPE2、AcPHS1 基因相对表达量在HY 猕猴桃果实中总体均比CY 果实中高，这可能导致了HY 淀粉降解速度更快。贮藏期间两品种猕猴桃果实AcGWD、AcPWD、AcLSF1 的相对表达量随着淀粉降解呈下降趋势，可能与淀粉含量有关。