超声波-双水相提取青果黄酮及其抗氧化性研究

熊庭雨，侯小勤，阮尚全，2*

(1.内江师范学院 化学化工学院，四川 内江 641199；2.四川省高等学校果类废弃物资源化重点实验室，四川 内江 641199)

0 引言

【研究意义】青果果实富含黄酮类、多酚类、三萜类、挥发性芳香物、蛋白质、氨基酸等多种物质，兼有食用和药用价值[1-2]，其中黄酮化合物具有抗氧化性、抗皱抗衰、抗炎、抗病毒、镇痛、降血压等功效，在食品加工、生物制药等方面都有极其重要的作用[3-5]。四川合江青果已有1 000余年的种植历史，主要为橄榄科橄榄属白榄种，常年产量超过600万kg，占四川青果产量的95%以上，具有一定的药用价值。开展青果黄酮提取方式的研究，对扩大青果活性物质在食品加工、生物制药等方面的开发利用具有现实意义。【前人研究进展】黄酮化合物提取技术主要有传统溶剂提取法、超声波辅助法、真空气流细胞破壁法、酶法、溶剂气浮分离技术、微波辅助萃取法、水热法提取等[6-13]。国内对青果总黄酮的提取方式主要是采用传统水提法、溶剂提取法、酶法、真空气流细胞破壁法等，而传统水提法提取率比较低，成本较高，且部分是有毒有害溶剂；酶法提取虽然提取率较高，但酶易失去活性，微波时间虽较短，但易破坏分子结构，产生对人体有害的物质[14]。【研究切入点】目前，鲜见超声波-双水相法提取合江青果黄酮的研究报道。【拟解决的关键问题】采用超声波-双水相技术提取合江青果的黄酮[15]，发挥其超声波的机械振动、空化作用以及硫酸铵作用条件较温和、分相时间短、易分相、有机溶剂残留少、选择性较好等优点，利用响应曲面优化建立提取黄酮的试验模型，并对提取物进行定性鉴定和抗氧化性试验，以期为合江青果的开发利用提供理论依据和新的试验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 青果 青果采自四川合江某青果生产基地，取果肉于50℃干燥箱中烘干，粉碎后过50目筛，装袋密封备用。

1.1.2 试剂 芦丁、无水乙醇、氢氧化钠、三氯化铝、亚硝酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、二苯代苦味酰基苯肼等试剂，均为分析纯，成都科龙化工试剂厂；RO膜过滤水，等。

1.1.3 仪器 BSA224S电子天平(赛多利斯上海公司)，电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，超声波清洗仪(江苏昆山)，TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)，T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 绘制标准曲线 将20.0 mg芦丁配制成浓度为400 μg/mL的溶液，分别吸取0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL置于25 mL比色管中，参照文献[16]的方法处理并测定吸光度，得到吸光度(A)与浓度(C)的一元线性回归方程：

A=0.012 28C+0.042 68(R2=0.999 9)

1.2.2 分相盐的筛选 精确称取2份青果粉各1.000 g，各加入60%乙醇溶液30 mL，然后分别加入7 g硫酸铵或5 g磷酸氢二钾，混匀静置10 min，在超声波功率为280 W、温度为60 ℃下提取60 min，在转速为4 000 r/min下趁热离心分离10 min，用30%乙醇将离心液定容于50 mL容量瓶中，精确量取0.50 mL于比色管中，参照1.2.1步骤进行显色测定，计算青果黄酮提取率，比较2种分相盐的提取效果。

1.2.3 黄酮的提取及测定 精确称取1.000 g 青果粉放入50 mL提取瓶，加一定体积和浓度的乙醇，再加入分相盐混匀，静置10 min，按照一定功率、温度下超声提取一定时间，然后4 000 r/min转速下趁热分离10 min，取上层提取液用30%乙醇定容于50 mL容量瓶中，精确量取0.50 mL于比色管中，参照1.2.1步骤测定吸光度，计算黄酮提取率的流程进行单因素提取试验，分别考察乙醇浓度、液料比(mL∶g)、硫酸铵用量、提取时间、超声波功率和提取温度等因素对黄酮提取率的影响。其中，以7 g/30mL硫酸铵、60%乙醇溶液、超声波功率280 W、温度60℃、时间60 min和液料比30∶1为固定水平，根据各测定指标的变化试验条件相应因素作变换后进行提取。

1) 乙醇浓度。设置乙醇浓度为50%、60%、70%、80%和90%。

2) 液料比(mL∶g)。分别设定为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1。

3) 硫酸铵用量。分别设定为4 g/30mL、5 g/30mL、6 g/30mL、7 g/30mL、8 g/30mL和9 g/30mL。

4) 提取时间。分别设定为20 min、40 min、60 min、80 min和100 min。

5) 超声波功率。分别设定为200 W、240 W、280 W、320 W和360 W。

6) 提取温度。分别设定为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。

1.2.4 响应曲面设计优化提取工艺 以硫酸铵用量(A)/(g/30mL)、超声波功率(B)/W、提取时间(C)/min为设计因素，其他条件为单因素试验最佳条件，黄酮提取率(Y)为响应值，采用Box-Benhnken进行优化设计(表1)。

表1 青果黄酮提取率的响应曲面设计因素与水平Table 1 Factors and levels of the response surface design

1.2.5 验证试验 选择各因素最优水平，在便于操作的试验条件下，按照1.2.3的步骤进行5次平行验证试验，试验结果与理论模型值比较，检查试验模型的指导意义。

1.2.6 黄酮化合物的理化性质测定

1) 定性鉴定试验。取黄酮提取液2 mL于试管中，参照文献[17]的方法，分别滴加4%NaOH、10%Al(NO3)3、25%氨水溶液和饱和碳酸钠溶液，观察溶液颜色变化，初步鉴定黄酮类化合物的结构类型。

2) 清除DPPH·试验。分别取0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L、1.20 mg/L和1.40 mg/L黄酮提取溶液于比色管中，加入浓度为20 mmol/L的DPPH溶液，用95%的乙醇定容至4 mL，摇匀，避光静置30 min。参照文献[18]方法测提取液吸光度(Ai)，用相同方法以等体积95%乙醇溶液替代DPPH测定不加PDDH提取液的吸光度(Aj)，用等体积超纯水替代黄酮溶液测定空白对照吸光度(Ac)，考查提取液清除DPPH·的能力[19]。同时，用等浓度的芦丁、VC溶液进行比较试验，考查其清除能力的强弱。

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

1.3 统计分析

用Origin 7.5对试验数据作图，用Design-Expert 8.05进行相应曲面分析。

2 结果与分析

2.1 不同分相盐处理青果黄酮的提取率

经测定，以硫酸铵和磷酸二氢钾作分相盐时黄酮的提取率分别为2.88%和1.63%，硫酸铵较磷酸二氢钾作分相盐时的黄酮提取率高76.69%。此时试验废渣中硫酸铵与磷酸氢二钾均有剩余，表明，2种盐溶解已达到饱和状态。观察发现，试验中硫酸铵分相好，而磷酸氢二钾分相界面不清晰；同时，硫酸铵价格相对磷酸氢二钾便宜，环境污染小，因此，后续试验选取硫酸铵作为分相盐。

2.2 不同提取因素处理青果黄酮的提取率

从图1看出，不同提取因素对青果黄酮提取率的影响存在差异。

图1 不同提取因素处理青果黄酮的提取率

2.2.1 乙醇体积分数 随乙醇体积分数增加，黄酮提取率呈先升后降趋势；各处理青果黄酮的提取率为2.51%～3.13%，其中，乙醇体积分数为70%时黄酮提取率为最大值，60%时其次，50%时最低，依次为70%>60%>80%>90%>50%。乙醇体积分数为70%时黄酮提取率最大，其原因可能是：黄酮类化合物与乙醇均具有一定极性，根据相似相溶原理，70%的醇水体系能更好地相溶；同时乙醇浓度增大也增大其他脂溶性成分的溶解能力，当超过70%时，可能减小青果黄酮的溶解优势，致使其提取效果下降[20]。因此，乙醇体积分数以70%为最佳，后续试验乙醇体积分数为70%。

2.2.2 硫酸铵用量 黄酮提取率随硫酸铵用量增多呈先增后降趋势；各处理青果黄酮的提取率为3.16%～3.44%，其中，当硫酸铵用量达6 g/30mL时，黄酮提取率为最大值，7 g/30mL时其次，9 g/30mL时最低；依次为6 g/30mL>7 g/30mL>5 g/30mL>4 g/30mL>8 g/30mL>9 g/30mL。硫酸铵用量达6 g/30mL时黄酮提取率最大，其原因可能是：体系中硫酸铵与乙醇夺取水分子，因此当硫酸铵用量增多时，水分子从乙醇相中逐渐脱离，改变体系的极性，使得黄酮分子在醇层富集，提取率逐渐升高，但水分子分离时，可能导致一部分黄酮类化合物随之流失，不利于黄酮的提取[21]。由于硫酸铵用量在6 g/30mL时分相界面清晰且溶解达到饱和，因此硫酸铵最佳用量为6 g/30mL。后续试验硫酸铵用量为5 g/30mL、6 g/30mL和7 g/30mL。

2.2.3 液料比 随着液料比增加青果黄酮提取率呈先升后降趋势；各处理青果黄酮提取率为2.83%～3.16%，其中，液料比为35∶1时黄酮提取率最大，30∶1时其次，20∶1时最低；依次为35∶1>30∶1>40∶1>25∶1>20∶1。液料比为35∶1时黄酮提取率最大，其原因可能是：当提取液增多时，青果粉末与溶液接触面积增大，使反应更加容易，促进黄酮的提取。当液料比超过35 ∶1时，因硫酸铵溶解量不同而影响体系的分相结果，并且提取液增加可能使其他成分溶出，从而导致黄酮提取率下降。因此，液料比以35∶1最佳，后续试验液料比为35∶1。

2.2.4 超声波功率 随着超声波功率增加黄酮提取率呈先降后升再降趋势；各处理青果黄酮提取率为2.96%～3.34%，其中，超声波功率为280 W时黄酮提取率最大，240 W时其次，200 W时最低；依次为280 W>240 W>320 W>360 W>200 W。在超声波功率为280 W时提取率最大，其原因可能是：功率加大能量越高，利于解除其他成分对黄酮分子的羁绊，同时也使得黄酮分子越活泼，运动加快，提高提取率[22]；但功率过高一定程度上也破坏黄酮类化合物的结构，致使黄酮的提取效果下降。因此，超声波功率最佳为280 W，后续试验超声波功率为240 W、280 W和320 W。

2.2.5 提取时间 随着提取时间延长黄酮提取率呈先升后降趋势；各处理青果黄酮的提取率为2.87%～3.45%，其中，提取时间为80 min时黄酮提取率最大，60 min时其次，100 min时最低；依次为80 min>60 min>20 min>40 min>100 min。提取时间为80 min时黄酮提取率最大，其原因可能是随提取时间越久，对青果细胞壁作用越彻底，黄酮溶出越完全，使得产率增大，但当黄酮提取完成后，黄酮的降解起主导作用，同时溶剂逸散也会增加，从而使得黄酮提取率降低[23]。因此以提取时间80 min最佳。后续试验提取时间为60 min、80 min和100 min。

2.2.6 提取温度 随着提取温度升高，青果黄酮提取率呈先升后降趋势；各处理青果黄酮的提取率为3.05%～3.18%，其中，提取温度为60℃时黄酮提取率最大，70℃时其次，30℃时最低，依次为60℃>70℃>50℃>40℃>30℃。提取温度为60℃时黄酮提取率最大，其原因可能是温度增高，增加了黄酮分子的运动能量，更利于其突破相邻分子的羁绊而快速脱离束缚，使提取率增大；但温度过高则损坏一些黄酮的结构，影响其溶解性[24]，同时，也加大其他杂质分子的溶解活性导致黄酮提取率下降。因此，提取温度以60℃最佳。

2.3 提取工艺优化

2.3.1 优化试验 从表2看出，17个处理青果黄酮提取率为3.17%～3.50%，其中，处理1、处理2、处理8、处理9和处理15试验条件相同，均为硫酸铵用量6 g/30mL、超声波功率280 W、提取时间80 min，其青果黄酮提取率最高，为3.46%～3.50%；处理14和处理17其次，分别为3.42%和3.41%。各处理青果黄酮提取率依次为处理1>处理2>处理8=处理9=处理15>处理14>处理17>处理10>处理3>处理12=处理16>处理6>处理7>处理11>处理13>处理5>处理4。

表2 青果黄酮提取的响应面试验设计及结果

2.3.2 曲面模型与方差分析 经对上述结果进行多元回归拟合得到青果黄酮提取率(Y)与提取因素硫酸铵用量(A)、超声波功率(B)和提取时间(C)的回归方程：

Y=3.47+0.047A+0.007 5B-0.010C-0.005AB+0.01AC-0.11BC-0.094A2-0.094B2-0.073C2

表3 响应模型的方差分析结果 Table 3 Result of vaniance analysis in the responese surface model

2.3.3 响应面因素间的交互作用 从图2看出超声波功率与硫酸铵用量、提取时间与超声波功率、提取时间与硫酸铵用量相互作用对青果黄酮提取率作用的影响。

图2 超声波功率、硫酸铵用量及提取时间相互作用的青果黄酮提取率及其响应面与等高线

1) 超声波功率与硫酸铵用量。功率为272～288 W时黄酮提取率出现最大值；硫酸铵用量为5.5～6.5 g/30mL时出现最大值。当超声波功率一定时，随着硫酸铵用量增多，黄酮提取率呈先增后减趋势，等高线接近圆形；当硫酸铵用量一定时，黄酮提取率趋势一致，且坡度变化较为平缓。由此可知，超声波功率与硫酸铵用量互相作用效果不显著，与响应模型的方差分析一致。

2) 提取时间与超声波功率。黄酮提取率在时间为76～84 min时出现最大值，超声波功率为272～288 W时出现最大值。在较低超声波功率时，提取时间延长，黄酮提取率呈先增再趋于平缓，在较高超声波功率时，随着时间延长，黄酮提取率逐渐减少，等高线接近椭圆形。由此可知，提取时间与超声波功率互相作用效果显著，与响应模型的方差分析一致。

3) 提取时间与硫酸铵用量。黄酮提取率在时间为76～84 min时出现最大值，硫酸铵用量为5.5～6.5 g/30mL时出现最大值。在一定时间里，当硫酸铵用量逐渐增多时，青果黄酮提取率呈先增后减趋势；在一定硫酸铵用量时，随着时间增长，黄酮提取率呈先增后减趋势，等高线接近圆形。由此得出，硫酸铵用量与时间互相作用效果不显著，与响应模型的方差分析一致。

2.4 方案验证

以其他条件为单因素最佳条件，在硫酸铵用量6 g/30mL、超声波功率280 W、时间77 min时进行5次平行验证试验的结果表明，黄酮提取率平均为3.404%，与此条件下的理论响应值3.472%相比，相对误差为1.95%，说明模型拟合较好，可用于指导实际操作。

2.5 黄酮化合物的理化性质

2.5.1 定性鉴定 取黄酮提取液加入NaOH后溶液呈橙色，一段时间后变为红色，表明提取液含有二氢黄酮醇类化合物；加入Al(NO3)3时溶液变为黄色，表明含邻二酚羟基结构；加入氨水时溶液变为棕黄色，表明含各类黄酮类化合物；加入饱和碳酸钠时溶液变为橙色，一段时间后变为红色，表明含二氢黄酮醇类化合物，试验结果与文献报道[17]一致。

2.5.2 黄酮提取物对DPPH·的清除效果 从图4看出，在相同浓度条件下，青果黄酮清除DPPH·作用显著优于VC和芦丁。当处理浓度达1.0 μg/mL时，青果黄酮对DPPH·的清除率达88.04%，之后清除率基本保持不变，芦丁与VC浓度增大时，清除自由基能力也不断升高，但均明显低于青果黄酮。由此可得，青果黄酮对DPPH·有很好的清除效果，抗氧化能力较强。

图3 不同物质对DPPH·的清除率

3 讨论

研究利用超声波-双水相提取技术提取青果中的总黄酮，提取方法更为多样性与温和性，避免了只利用超声波方法的单一性，也可防止酶法中温度过高对部分有效成分产生分解与酶失活现象。田应娟等[25]采用超声强化提取橄榄黄酮类物质发现，在提取温度60℃，超声波功率350 W，乙醇体积分数70%，提取时间60 min，液料比40 mL/g的最佳提取条件下，总黄酮提取率为2.30%。阮尚全等[26]采用Box-Behnken设计优化酶法提取青果黄酮发现，在最佳提取条件[酶用量为15 U/mL，提取时间85 min，提取温度60℃，乙醇体积分数60%，料液比1∶30 (g/mL)]下，青果黄酮提取率为3.14%。而在经该研究优化的提取条件下，青果黄酮提取率为3.304%，较之超声波提取法[25]和酶法[26]等，该方法的黄酮提取率最较高，更有利于黄酮的提取。采用超声波-双水相提取青果黄酮，可为合江青果的进一步开发利用提供了理论依据和新的试验方法。

4 结论

研究结果表明，超声波和双水相技术结合提取合江青果黄酮，缩短了提取时间，实现了提取与纯化的同步进行。利用Box-Behnken设计得到提取的理论模型，在超声功率为280 W、硫酸铵用量为6 g/30mL、提取时间为77 min、液料比(mL∶g)为35︰1、温度为60℃、乙醇体积分数为70%时，青果黄酮提取率为3.404%，与理论模型值3.472%的相对误差为1.95%；提取液中黄酮类成分定性鉴定现象明显，且提取物对DPPH·的清除存在量效关系，清除能力强于芦丁、VC，黄酮物质清除DPPH·效果较好。