汞胁迫对草坪草及牧草幼苗生理及养分积累特性的影响

杜建雄,任尉香,张淑卿,李剑峰,周丕飞

(1.贵州财经大学 管理科学学院, 贵州 贵阳 550025； 2.贵州师范大学 外国语学院 贵州 贵阳 550025； 3.贵州师范学院 喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所, 贵州 贵阳 550018)

0 引言

【研究意义】土壤是人类及其他生物赖以生存必不可少的环境要素，其能承担环境中大约90%的污染物。Hg是土壤中主要的重金属污染物之一，污染环境的同时也严重威胁人类健康，Hg对人体的伤害大多是农作物从土壤吸收经食物链传递导致[1-5]。因此，进行土壤汞污染治理修复研究对土壤的可持续发展能力和我国的粮食安全具有重要意义。【前人研究进展】世界上治理修复土壤汞污染主要采用农业工程技术[6]、植物修复技术[7]和物理化学修复技术[8]。农业工程技术和物理化学修复技术受一定的技术条件限制，适合局部区域治理，植物修复技术是通过植物将土壤中Hg2+固定、转移、提取达到减轻污染的目的[9]，植物修复技术已逐渐成熟，具有效率高、低成本、操作简单，不易造成二次污染的特点，在治理土壤污染的同时还具有美化环境、净化空气的作用，成为重金属污染土壤修复的研究热点。大多数草本植物有一定的抗Hg能力，可以在一定程度重金属污染的土壤环境中生存[10-11]。已有研究表明，一些草本植物对Hg有较高的富集能力，而且能通过不断刈割这些草本植物最终将将土壤中的Hg2+富集后再转移出土壤，达到既能修复土壤、又能减少农产品污染和重金属在食物链中扩散的目的[12-13]。【研究切入点】目前关于草坪草、牧草对土壤汞污染修复的相关研究比较少，因此，选取前期耐汞发芽试验中筛选出的一年生黑麦草(LoliummultiflorumLam.)盛宴(cv.Feast)、紫羊茅(FestucarubraL.)派尼(cv.Pernille)和传奇(cv.Legend)以及紫花苜蓿(MedicagosativaL.)金皇后(cv.Golden empress)4个草坪草、牧草品种进行不同浓度汞胁迫土培试验，探究汞胁迫处理下4个草坪草、牧草品种幼苗的生理反应特性及养分积累情况。【拟解决的关键问题】探明4个草坪草、牧草品种的抗汞胁迫能力，为土壤汞污染的治理提供植物修复材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试草种 一年生黑麦草盛宴、紫羊茅派尼和传奇的种子均于2016年购自百绿集团，紫花苜蓿金皇后种子由甘肃农业大学教育部草业生态系统重点实验室提供。所有供试种子净度均>98%。

1.1.2 试验土壤 试验土壤采集于贵州省铜仁市万山区的万山汞矿区。1号土壤采集地距矿区约650 m，土壤为栽种玉米3a的黄壤土；2号土壤采集地距矿区约500 m，为种植玉米约2 a的黄壤复耕地；3号土壤采集地距排矿口20 m，土壤以矿渣为主，混合荒地土，栽种玉米约2 a； 4号土壤采集地距排矿口30 m，荒地，以汞矿渣为主，生长少量杂草；非汞矿区土壤(CK)采集于贵州师范学院印山林地。采集各土样均为表层0～20 cm的非根际土壤，去杂质后120℃烘干1.5 h，碾碎过1 mm筛备用，其初始理化性质见表1。

表1 供试土壤的基本理化性质

1.2 方法

采用土培盆栽试验，每个土样为1个处理，共5个处理，5次重复。将采回的5个土壤样本分别按150 g/盆土装入直径6 cm、高8 cm的小花盆中，每个花盆均匀散播100粒种子，覆0.5 cm土壤，浇透水。第15天统计其成活数，观察外伤症状。30 d后取样测定各项生长指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 叶绿素含量 用分光光度计法测定[14]。称取0.20 g新鲜叶片剪碎，加10 mL95%的乙醇避光浸泡至叶片呈白色。以95%乙醇作空白对照，分别在波长665 nm、649 nm处测定叶片的吸光度，计算叶片叶绿素含量。

Ca=13.95×A665-6.88×A649

Cb=24.96×A649-7.32×A665

CT=Ca+Cb

式中，Ca、Cb、CT分别为叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素浓度，A665、A649分别为色素提取液在波长665 nm、649 nm处的吸光值。

1.3.2 叶绿素荧光 植株叶片暗适应20 min后，用(MINI-PAM-II)型便携式调制荧光分析仪测定植物叶片PSII的原初光化学效率(Fv/Fm)。

1.3.3 丙二醛和可溶性糖含量 以硫代巴比妥酸法[15]测定叶片MDA含量和可溶性糖含量。取植物叶片1.0 g，加10%三氯乙酸(TCA) 2 mL和少量石英砂研磨，继续加入8 mL TCA充分研磨，匀浆液4 000 r/min离心10 min，取上清液低温保存待测。吸取2 mL提取液(对照加2 mL蒸馏水)，加入2 mL 0.6%TBA液混匀，试管加塞并沸水浴15 min，冷却后以4 000 r/min离心15 min，取上清液测定532 nm和450 nm处的吸光值。根据Lambert-Beer定律计算MDA和可溶性糖含量。

C1(μmol/L)=6.45×A532-0.56×A450

C2(μmol/L)=11.71×A450

式中，C1为MDA的浓度，C2为可溶性糖的浓度，A450、A532分别为450 nm、532 nm波长下的吸光值。

1.3.4 根际土壤铵态氮、有效磷、速效钾含量 用毛刷将植株根系附着的根际土刷下并于80℃烘干至恒重，称取2 g待测土，用HM-TYA型(山东恒美)土壤养分检测仪测定铵态氮、有效磷和速效钾含量。

1.3.5 植株速效氮、速效磷及速效钾含量 取新鲜植株样品1.0 g，洗净擦干，加石英砂研磨后用提取液稀释，用HM-TYA型土壤植株养分检测仪测定植株的速效氮、速效磷及速效钾含量。

1.3.6 根系活力 用TTC法测定根系活力[16]。TTC标准曲线的制作：取0.4% TTC溶液0.2 mL放入10 mL量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀显色后再用乙酸乙酯定容至刻度摇匀后，分别取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度即得到反应产物25 μg、50 μg、100 μg、150 μg、200 μg的标准比色系列，对照空白，在485 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

称取根尖样品0.5 g放入10 mL烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温13 h后，加入1 mol/L硫酸2 mL停止反应；同时作空白对照，先加硫酸，再加根样，其他操作同上。

把根取出吸干水分后与乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂于研钵内磨碎，以提出三苯基甲臜(TTF)。

1.4 数据分析

利用Excel 2007对原始数据进行整理及制图，用SPSS 13.0对试验数据进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 叶绿素含量

由图1可见，随着Hg2+浓度升高，各品种的叶绿素含量变化各异。处理1盛宴的叶绿素含量较对照无显著变化，金皇后和派尼显著上升，传奇显著下降。处理2传奇的叶绿素含量较对照无显著变化，盛宴、金皇后和派尼均呈显著升高，增幅分别为36.66%、12.05%和15.68%。处理3除派尼的叶绿素含量较对照显著降低外，其他品种变化不大。处理4盛宴、传奇和派尼的叶绿素含量较对照均显著下降，降幅分别为19.60%、22.59%和27.17%；金皇后则显著升高，增幅为14.52%。4种土壤中，金皇后的叶绿素含量变化较平缓。

图1 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的叶绿素含量

2.2 PS II原初光能转化效率(Fv/Fm)

由图2可见，随着Hg2+浓度升高，盛宴、金皇后和传奇的PS II原初光能转化效率无显著变化，派尼则显著升高；其中，盛宴和传奇均呈先升后降再升趋势，金皇后呈先降后升再降趋势。

2.3 丙二醛(MDA)含量

由图3可见，随着Hg2+浓度升高，盛宴的MDA含量呈先降后升再降趋势，与对照相比，处理1、处理3和处理4降幅分别为17.01%、39.46%和27.56%。金皇后的MDA含量随Hg2+浓度升高呈明显升高后下降的趋势，与对照相比，处理1的MDA含量增幅为29.59%，处理2、处理3和处理4降幅分别为23.43%、15.76%和19.89%。传奇的MDA含量随Hg2+浓度升高呈先降后升再降趋势，处理1、处理2、处理3和处理4降幅分别达66.27%、79.37%、65.31%和88.68%。派尼的MDA含量随Hg2+浓度升高而明显升高，处理1、处理3和处理4的MDA含量较对照增幅分别达29.76%、40.42%和87.24%，处理2变化不大。

图3 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的丙二醛含量

图2 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的PS II原初光能转化效率

2.4 可溶性糖含量

由图4可见，盛宴的可溶性糖含量随Hg2+浓度升高整体呈降低趋势；金皇后呈先显著上升再显著下降后基本稳定的趋势，在Hg2+浓度最高的处理4可溶性糖含量与对照接近；传奇呈先降后升再降趋势，处理1和处理2土壤的可溶性糖含量降幅较大，分别为47.05%和47.31%；派尼呈显著下降后略升趋势，处理1～4均显著低于对照。

图4 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的可溶性糖含量

2.5 根系活力

由图5可见，随着土壤Hg2+浓度升高，盛宴和金皇后的根系活力均呈先下降再缓慢上升趋势，处理1～4显著低于对照，金皇后的根系活力较对照降幅为34.41%～75.49%。传奇的根系活力处理1和处理2与对照间无显著变化，处理3显著上升，处理4显著降低，处理1～4均低于对照。派尼的根系活力随Hg2+浓度升高呈先降后升趋势，含汞土壤中的根系活力显著低于无汞土壤，降幅为30.46%～88.21%。

图5 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的根系活力

2.6 速效氮含量

由图6可见，盛宴植株速效氮含量随Hg2+浓度升高呈先下降再快速升高趋势，处理1、处理2和处理3的速效氮含量较对照的降幅分别为25.56%、13.37%和11.38%，处理4的增幅则达26.81%。金皇后的速效氮含量随Hg2+浓度升高呈先升后降趋势，增幅分别为46.92%、92.34%、58.67%、70.65%，差异显著。传奇的速效氮含量随Hg2+浓度升高呈先升后降趋势。派尼的速效氮含量随Hg2+浓度升高呈先升后降再升趋势，处理1、处理2、处理4较对照的增幅分别为49.45%、36.05%和12.27%，5个处理间差异均达显著水平。

图6 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的速效氮含量

2.7 速效磷含量

由图7可见，盛宴的速效磷含量随Hg2+浓度升高呈先降后升趋势，各处理间速效磷含量差异均达显著水平，处理1、处理2的速效磷含量较对照的降幅分别为23.71%和12.64%，处理3、处理4的速效磷含量较对照的增幅分别为23.63%和17.60%。金皇后的速效磷含量随Hg2+浓度升高呈持续升高的趋势，除处理1和处理3间的速效磷含量差异不显著外，其余各处理间差异均达显著水平，处理1、处理2、处理3、处理4的速效磷含量较对照的增幅分别达191.36%、84.67%、178.90%和156.84%。传奇的速效磷含量随Hg2+浓度的升高呈先降后升再降的趋势，对照和3号土壤的速效磷含量与其他其他处理的差异均达显著水平，处理1、处理2、处理4的速效磷含量较对照的降幅分别为66.98%、70.74%和63.36%。派尼的速效磷含量各处理间差异不显著。

图7 不同浓度Hg2+胁迫下4个草品种的速效氮含量

2.8 速效钾含量

由图8可见，盛宴的速效钾含量随Hg2+浓度升高呈先降后升趋势，对照和处理1间差异不显著，与其他处理间差异均显著，处理1、处理2和处理3的速效钾含量较对照的降幅分别为3.72%、48.37%和23.91%，处理4较对照增加3.66%。金皇后的速效钾含量随Hg2+浓度升高呈持续升高的趋势，除处理3和处理4间差异不显著外，其他处理间差异均达显著水平，处理1、处理2、处理3和处理4的速效钾含量较对照的增幅分别为28.93%、10.65%、176.27%和171.13%。传奇的速效钾含量随Hg2+浓度的升高呈先降后升再降的趋势，各处理间差异均达显著水平。派尼的速效钾含量随着Hg2+浓度升高仅处理2升高外，其余处理均明显下降，处理3、处理4的速效钾含量较对照的降幅分别为38.22%和71.39%。

图8 不同浓度Hg2+胁迫下4个品种的速效钾含量

3 讨论

叶绿素荧光参数中的Fv/Fm值常用于衡量植物在逆境胁迫下叶片光合系统II原初光能转化效率[17-18]，Hg胁迫对不同草坪草、牧草的Fv/Fm值影响可能并不一致。低浓度Hg能促进盛宴、传奇、派尼的叶片光合系统II原初光能转化效率。而金皇后在不同Hg处理下的叶片Fv/Fm值显著低于非汞矿区土壤，可能是Hg胁迫使金皇后光系统PS II反应中心受损，光合作用的原初反应产生抑制，使光合电子传递受阻，不利于金皇后叶片把捕获的光能转变为化学能[17-18]。其次，光合作用与叶绿素含量也有密切关系，金皇后在各处理中的叶绿素值基本高于CK，盛宴与CK无明显差异，传奇和派尼则低于CK。说明叶绿素含量受Hg胁迫影响程度依次为金皇后<盛宴<传奇<派尼。

植物器官在逆境下或衰老时，常会发生膜脂过氧化作用，从而产生MDA，因此常将MDA含量作为脂质过氧化指标，用以表示细胞膜过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[19-20]。盛宴、金皇后、传奇的MDA含量在非汞矿区土壤达到最大值，可能是由于土质问题，CK的土壤取自贵州师范学院宝珠山上松树林周边，取土周围无太多草本植物生长，由此推断，土壤中可能含有某种松树分泌的化感物质，致使试验草植株体的MDA含量升高。而派尼的MDA含量在Hg浓度最高的土壤中最高，说明Hg2+比松树分泌的化感物质对派尼的细胞膜影响程度更大，即盛宴、金皇后、传奇比派尼更耐受Hg2+的胁迫。可溶性糖含量的升高是植物面对胁迫环境时的应激反应[21]，派尼和传奇随着Hg浓度的升高，其可溶性糖含量下降明显，盛宴的可溶性糖含量则与非汞矿区土壤无明显区别，金皇后的可溶性糖含量在最低浓度处理下呈升高现象，后趋平缓状态，说明面对胁迫环境，金皇后比其他3种草的应激反应能力更强，其余依次是盛宴、传奇和派尼。

根系活力(四氮唑还原强度)是根的重要生理指标，活力越高吸收水分和营养的能力越强，当受逆境如重金属、盐碱、干旱等胁迫时植物根系活力降低[22-23]。盛宴、金皇后、传奇的根系活力随着Hg胁迫浓度升高而先下降后上升，但根系活力均明显低于对照，特别是中低浓度Hg胁迫下根系活力下降，而高浓度胁迫下反而升高，说明经过低浓度抗汞胁迫锻炼，根系产生一定耐抗能力，根系活力有所提高，以抵抗更严苛的胁迫。而派尼的根系活力较CK下降明显，同时也说明其抗汞胁迫能力较弱。

氮、磷、钾 为植物必须的三大营养元素，对植物的生长发育具有非常重要的作用，Hg2+通过与养分竞争植物根系的吸收部位，干扰植物对养分的吸收和利用[24-26]。研究表明，Hg2+对4个草品种N、P、K的积累影响较大，盛宴、金皇后的氮、磷、钾积累量均随Hg2+浓度的升高先降后升，且品种间存在差异，2品种的氮、磷、钾积累量在高浓度Hg胁迫下反而升高，其原因可能是基质中高浓度的Hg2+提高了氮、磷、钾的有效态含量，导致植物对氮、磷、钾的吸收含量增加。而传奇和派尼的氮、磷、钾积累量持续下降，原因可能是Hg2+降低了氮、磷、钾的有效态含量。金皇后和盛宴在高浓度Hg胁迫下氮、磷、钾积累量的升高进一步印证了其较强的抗汞胁迫能力。

4 结论

在Hg2+0～181 mg/kg处理范围内，金皇后和盛宴的耐Hg胁迫能力较好，更适宜在低Hg污染地区推广种植；传奇耐汞能力次之，派尼最弱，不适宜在汞污染区推广种植。由于试验草种仅为4种，只能为耐Hg胁迫草坪草、牧草品种的选育、栽培策略优化和Hg污染土壤生物修复等研究提供一定的参考。对选育出高富集Hg能力的草品种还需进行大量的试验。