HPLC法测定羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中的 5-羟甲基糠醛

张瑜，黄萍，陈雪飞，郑小变

(1.华仁药业<日照>有限公司，山东 日照 276800；2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；3.大道隆达<北京>医药科技发展有限公司，北京 100086)

羟乙基淀粉130/0.4是以玉米淀粉为原料通过酸水解和羟乙基化处理而得到的分子量为130 000 Da，摩尔取代度约为0.4的一种物质；以羟乙基淀粉130/0.4制成的注射液为血液容量扩充剂，用于治疗和预防血容量不足，急性等溶血液稀释(ANH)。羟乙基淀粉130/0.4属于多糖类化合物[1]，在水溶液中与葡萄糖类似，经过高温灭菌后，有5-羟甲基糠醛的产生。5-羟甲基糠醛是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸性等条件下脱水产生的具有呋喃环结构的醛类化合物，是麦拉德反应的典型产物之一[2]。5-羟甲基糠醛过量对人体有一定的损害[3-6]，其不良反应临床多表现为过敏性休克及呼吸系统损伤[7-8]，并具有一定的肾毒性[9]。为保证制剂的质量及临床用药安全,需对灭菌工艺参数及药液pH进行筛选并加以控制，尽可能降低制剂中5-羟甲基糠醛的含量。5-羟甲基糠醛检测的方法有比色法、紫外法和高效液相色谱(HPLC)法，其中干扰较少、准确度较高的为HPLC法[3-6]。本文采用HPLC法测定羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中的5-羟甲基糠醛，建立了5-羟甲基糠醛的分析方法，经验证，该方法适用于羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中的5-羟甲基糠醛的检测，为控制该制剂的质量提供科学依据。

1 试验材料

1.1 样品来源 羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠注射液[华仁药业(日照)有限公司]，规格：500 mL：羟乙基淀粉130/0.4 30 g与氯化钠4.5 g，批号：190622R1、190623R1、190703C1。

1.2 仪器与试药 2030Cplus岛津高效液相色谱仪，LC-2030紫外检测器(一体机)，6.50SP1岛津网络版工作站；Mettler AE240电子天平；5-羟甲基糠醛对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711)；甲醇(色谱纯，Fisher)；注射用水(石家庄四药有限公司，批号：1906023204)；纯化水。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 采用VP-ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇∶水(10∶90)为流动相，检测波长为284 nm。柱温30 ℃，流速：1.0 mL·mL-1。理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液 精密称取5-羟甲基糠醛11.62 mg，置100 mL量瓶中，加注射用水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为5-羟甲基糠醛贮备液(0.116 2 mg·mL-1)。

精密量取5-羟甲基糠醛贮备液2 mL，置100 mL量瓶中，加注射用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(2.324 μg·mL-1)。

2.3 供试品溶液 精密量取本品5 mL，置25 mL量瓶中，加注射用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(含羟乙基淀粉130/0.4：12 mg·mL-1)。

2.4 定量限溶液 精密量取对照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置20 mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液(0.006 μg·mL-1)。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 照“2.1”项下色谱条件，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液(注射用水)各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见图1。对照品溶液中5-羟甲基糠醛保留时间为4.769 min，供试品溶液中5-羟甲基糠醛保留时间为4.766 min。结果表明，理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算为6 860，空白溶液与供试品溶液均不干扰5-羟甲基糠醛检测。

A.对照品溶液；B.供试品溶液图1 5-羟甲基糠醛测定HPLC图谱

2.5.2 线性关系考察 在定量限溶液浓度至5-羟甲基糠醛对照品溶液的200%浓度范围内制备线性溶液，浓度分别为0.006、1.162、1.859、2.324、2.789、3.718、4.648 μg·mL-1。

精密量取上述线性溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积。以5-羟甲基糠醛浓度X(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=1 211 941.060 7X+375.233 5(r=1.000 0)。结果表明，5-羟甲基糠醛在0.006～4.648 μg·mL-1范围内呈良好线性关系。

2.5.3 精密度试验 精密量取对照品溶液20 μL按上述色谱条件连续进样6次，记录各色谱图峰面积，RSD为0.96%，结果表明，仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取“2.3”项下制备的供试品溶液，精密量取20 μL，分别在0、1、2、4、8、12 h，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中5-羟甲基糠醛峰面积的RSD为0.21%，在12 h内溶液稳定。

2.5.5 重复性试验 精密量取供试品溶液20 μL按上述色谱条件连续进样6次，记录各色谱图峰面积，计算每份样品的5-羟甲基糠醛含量，RSD为0.66%，结果表明，本方法重复性良好。

2.5.6 回收率试验 供试品溶液：精密量取本品(批号：190622R1)5 mL，置25 mL量瓶中，加注射用水使溶解，作为供试品溶液。

分别精密量取供试品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，再分别精密量取“2.5.2”项下制备的4.648 μg·mL-1的对照品溶液4、5、6 mL，分置于上述10 mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀，作为加标80%、100%、120%的供试品溶液，每个浓度平行配制3份。

分别精密量取加标80%、100%、120%的供试品溶液及对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算5-羟甲基糠醛的回收率，平均回收率为102.0%，RSD=0.59%(n=9)，结果见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.5.7 检测限LOD与定量限LOQ 取“2.2”项下对照品溶液，逐级稀释并进样，以信噪比为3∶1时，计算检测限；以信噪比10∶1时，计算定量限。结果：检测限LOD=0.03 ng，定量限LOQ=0.1 ng。

2.6 样品测定 按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，以“2.2”项下溶液作为对照品溶液，测定3批样品中5-羟甲基糠醛的含量，测定结果见表2。

表2 样品中5-羟甲基糠醛测定结果

3 讨论

羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠注射液为羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠的灭菌水溶液，参考《中国药典》2020年版(二部)[10]中收载的葡萄糖注射液的质量标准中关于5-羟甲基糠醛检查的规定，考虑到羟乙基淀粉130/0.4属于糖类，在溶液中与葡萄糖类似，有5-羟甲基糠醛的产生，故对本品中可能含有的5-羟甲基糠醛进行质量研究。

《中国药典》2020年版(二部)葡萄糖注射液项下，5-羟甲基糠醛的检测方法中，10 mg·mL-1的葡萄糖溶液，在284 nm处测定吸光度不得大于0.32[10]。故本研究中，取5-羟甲基糠醛对照品，用注射用水定量稀释制成每1 mL约含2.324 μg的溶液，在284 nm处进行吸光度测定，吸光度为0.315，小于0.32。因此，当样品浓度为10 mg·mL-1时，5-羟甲基糠醛的限度浓度为2 μg·mL-1，即限度为0.02%(以葡萄糖计)[10]。参考葡萄糖注射液项下5-羟甲基糠醛检测方法，拟定本品中5-羟甲基糠醛的限度为不得过0.017%(以羟乙基淀粉130/0.4计，12 mg·mL-1)。

本研究采用高效液相色谱法对羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中的5-羟甲基糠醛进行考察，建立了5-羟甲基糠醛的分析方法，经方法学验证方法适用于羟乙基淀粉130/0.4中的5-羟甲基糠醛的检测。