超高效液相色谱-质谱联用法测定盐酸雷尼替丁及制剂中痕量N-亚硝基二甲胺

2021-09-13文松松谭会洁杨书娟窦艳丽王雪徐玉文牛冲

药学研究 2021年8期

文松松，谭会洁，杨书娟，窦艳丽，王雪，徐玉文，牛冲

(山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东济南 250101)

N-亚硝基二甲胺(N-dimethylnitrosamine,NDMA)又名N-二甲基亚硝胺，是一种半挥发性有机化合物，易溶于水及醇、醚等有机溶剂，极易光解，经消化道、呼吸道吸收迅速，经皮肤吸收缓慢，具有很强的肝脏毒性[1-2]。根据世界卫生组织公布的致癌物质清单，NDMA属于2A类致癌物质，且ICH M7指南也明确指出亚硝胺类化合物属于高致癌性物质。自2018年以来，国内外多家药企都曾因在药品中检出NDMA而启动召回。2020年4月1日，因正在进行的针对雷尼替丁(ranitidine)药物的调查研究发现，此类药物含有NDMA，美国食品药品监督管理局(FDA)宣布，要求药品制造商立即从市场上撤回所有雷尼替丁的处方药和非处方药物。因此，对我国市场的盐酸雷尼替丁相关药品进行NDMA的质量控制具有重要意义。

目前，NDMA的检测方法主要有表面增强拉曼散射检测法、分子印迹聚合物电化学法、高效液相色谱-化学发光检测法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等，主要应用于食品、化妆品和烟草行业。而国内外关于药品中NDMA检测的研究较少，对盐酸雷尼替丁中NDMA的测定未见报道[3-6]。本研究首次建立了超高效液相色谱-质谱联用技术测定盐酸雷尼替丁及制剂中痕量基因毒性杂质NDMA的方法，并进行了详细的方法学验证，样品前处理简便快速、灵敏度高、专属性强、重复性好，为盐酸雷尼替丁及其制剂中NDMA的质控提供了良好的解决方案。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Q Exactive plus超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；Mettler XS205 型电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；THZ-82型水浴恒温振荡器(常州金坛精达仪器制造有限公司)。

1.2 试药 52批盐酸雷尼替丁、33批盐酸雷尼替丁胶囊、3批盐酸雷尼替丁片均为药企委托检验提供；NDMA对照品(TCI公司，纯度>99.0%)；乙腈、甲醇(Fisher公司，LC-MS级)。

2 方法与结果

2.1 液相色谱质谱条件

2.1.1 液相色谱条件色谱柱为ACE Excel 3 C18-AR(4.6 mm×150 mm,3 μm)，流速为0.5 mL·min-1，柱温为30 ℃，自动进样器温度为8 ℃；进样量5 μL。流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱(0～1 min，5%B；1～3 min，5%B→20%B；3～7 min，20%B→100%B；7～9 min，100%B；9～14 min，100%B→5%B)。六通阀切换设置：仅将5～7 min流动相切入质谱系统。

2.1.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，采用正离子平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM) 模式，鞘气流速为55 L·min-1，辅助气流速为15 L·min-1，喷雾电压为3.5 kV，毛细管温度为350 ℃，辅助气体加热器温度为400 ℃。

扫描范围m/z50～95，选择m/z为75.055 8的离子进行监测，碰撞能量(NCE)为30。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取NDMA 约100 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液。

2.2.2 盐酸雷尼替丁供试品溶液制备取供试品约300 mg，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入甲醇10 mL，涡旋混匀1 min，再振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液即得。

2.2.3 盐酸雷尼替丁胶囊供试品溶液制备取本品内容物适量(约相当于雷尼替丁300 mg)，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入甲醇10 mL，旋涡振荡1 min，再振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 盐酸雷尼替丁片供试品溶液制备取本品5片，精密称定，研细，取细粉适量(约相当于雷尼替丁300 mg)，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入甲醇10 mL，旋涡振荡1 min，再振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.2.5 阴性对照样品溶液制备按处方组成及制剂工艺流程分别制备盐酸雷尼替丁胶囊和盐酸雷尼替丁片的阴性对照样品，再按照供试品溶液制备方法分别制备阴性对照样品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验分别精密量取溶剂甲醇、阴性对照样品溶液、对照品溶液及供试品溶液5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。NDMA的保留时间为6.14 min，溶剂、阴性对照样品溶液及盐酸雷尼替丁供试品溶液在相同保留时间位置均无干扰峰，表明本方法的专属性良好，色谱图见图1。

图1 专属性试验色谱图

2.3.2 线性范围取NDMA适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含100 ng的溶液，作为贮备液。分别精密量取1、1、1、3、5 mL，分置100、50、10、20、10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，与贮备液一起作为系列对照品溶液。分别精密量取5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标绘制标准曲线。结果NDMA在1.01～100.7 ng·mL-1浓度范围内，线性关系良好，线性方程为Y=210 449X+15 613，相关系数(R2=1)。

2.3.3 检测限和定量限取“2.2”项下对照品溶液，用甲醇逐级稀释制成信噪比(S/N)约为3的溶液，作为检测限溶液；信噪比(S/N)约为10溶液，作为定量限溶液。分别精密量取5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。结果NDMA的检测限为0.03 ng·mL-1，定量限为0.2 ng·mL-1。

2.3.4 仪器精密度试验精密量取“2.2”项下对照品溶液5 μL，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录总离子流图。结果NDMA峰面积的RSD为3.2%，表明本方法的仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验按“2.2”项下方法制备盐酸雷尼替丁、盐酸雷尼替丁胶囊及盐酸雷尼替丁片供试品溶液各6份，分别精密量取5 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。盐酸雷尼替丁中NDMA含量的平均值为0.23 ppm，RSD为1.1%(n=6)；盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA含量的平均值为0.68 ppm，RSD为2.2%(n=6)；盐酸雷尼替丁片中NDMA含量的平均值为0.33 ppm，RSD为0.9%(n=6)，表明本方法的重复性良好。

2.3.6 回收率试验盐酸雷尼替丁原料：取盐酸雷尼替丁原料药约300 mg，精密称定，置50 mL离心管中，分别精密加入50 ng·mL-1的对照品贮备液0.4、2、3 mL，各加3份，再精密加入甲醇9.6、8、7 mL，涡旋混匀1 min，振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液。

盐酸雷尼替丁胶囊及片：取阴性对照样品适量(约相当于雷尼替丁300 mg)，精密称定，置50 mL离心管中，分别精密加入50 ng·mL-1的对照品贮备液0.4、2、3 mL，各加3份，再精密加入甲醇9.6、8、7 mL，涡旋混匀1 min，振摇40 min，离心，取上清液滤过，取续滤液作为供试品溶液。

分别精密量取上述溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。按外标法以峰面积计算NDMA含量，扣除本底含量后计算平均回收率。结果盐酸雷尼替丁中NDMA的平均回收率为98.5%，RSD为3.0%(n=9)；盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA的平均回收率为98.9%，RSD为4.0%(n=9)；盐酸雷尼替丁片中NDMA的平均回收率为97.7%，RSD为4.1%(n=9)，表明本方法的回收率良好，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.3.7 稳定性试验按“2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图。结果对照品溶液中NDMA峰面积的RSD为4.7%，盐酸雷尼替丁、盐酸雷尼替丁胶囊及盐酸雷尼替丁片中NDMA峰面积的RSD分别为0.7%、1.5%、0.9%。表明各溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 方法耐用性试验通过改变离子源温度(±30 ℃)、流速(±0.05 mL·min-1)、柱温(±5 ℃)考察本方法的耐用性，结果离子源温度、柱温微调后，NDMA峰面积基本一致；流速微调后，NDMA峰保留时间有微小变化，但峰形无明显差异，表明本方法耐用性良好。

2.3.9 样品测定取88批盐酸雷尼替丁及制剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录总离子流图，按外标法以峰面积计算NDMA的含量。52批盐酸雷尼替丁中NDMA含量在0.04～1.16 ppm之间；33批盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA含量在0.47～1.91 ppm之间；3批盐酸雷尼替丁片中NDMA含量在0.11～0.33 ppm之间。

3 讨论

3.1 质谱条件的优化根据国家药品监督管理局关于盐酸雷尼替丁药物中NDMA的暂定限度(0.032 ppm)，NDMA检测方法的定量限应至少为0.016 ppm(S/N≥10)，对仪器的灵敏度要求非常高，而盐酸雷尼替丁在高温下易降解产生NDMA[7]。因此，为实现NDMA的痕量检测，本研究采用超高效液相色谱-质谱联用技术，正离子平行反应监测(PRM)模式，选择m/z75.055 8的离子进行选择性监测，并对离子源温度、气流速、电压等参数进行了优化，消除了基质和其他杂质的干扰，提高了NDMA的检测灵敏度。

3.2 色谱条件的优化供试品溶液中雷尼替丁的浓度高达30 mg·mL-1，如果进入质谱系统，会污染离子源产生严重的基质效应，影响NDMA的检测灵敏度，因此，本研究采用阀切换技术，将雷尼替丁峰切换至废液，避免高浓度的雷尼替丁污染离子源。此外，雷尼替丁保留较差，在普通色谱柱上容易与NDMA发生共同洗脱，干扰NDMA的检测，本研究通过考察不同品牌、不同规格色谱柱，优化梯度洗脱条件、流速等，最终选择ACE Excel C18-AR(4.6 mm×150 mm，3 μm)色谱柱，流速为0.5 mL·min-1，实现了NDMA峰与雷尼替丁峰的较好分离[8]。NDMA峰的保留时间约为6.2 min，雷尼替丁的保留时间约为8.5 min，将5～7 min的流动相切入质谱系统，有效避免雷尼替丁带来的基质干扰，提高NDMA检测结果的准确性。