6株芽孢杆菌的分离鉴定和生物学特性

田照辉 徐绍刚 董颖 胡红霞 王巍 东天 孙爱

摘要：为了筛选适合渔用微生态制剂的益生菌，从池塘边发酵鱼肉汤中分离芽孢杆菌，结合形态学、生理生化特征、16S rRNA及gyrA、gyrB、rpoB和purH基因序列比对分析对其进行鉴定，并对其产淀粉酶、产蛋白酶能力及生长情况进行研究。结果表明，分离筛选的6株芽孢杆菌分属于4个种，1株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），1株为阿氏芽孢杆菌（B. aryabhattai），2株为贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis），2株为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens），6株菌在LB液体培养基中生长良好，均具有产蛋白酶能力，其中4株具有产淀粉酶能力。

关键词：芽孢杆菌;分离鉴定;生物学特性;产淀粉酶能力;产蛋白酶能力

中图分类号： S917.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）13-0157-05

一直以来，抗生素和药物残留是食品安全的重要威胁，2018年农业农村部组织制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案》，推行减抗行动。微生态制剂能够提高动物的免疫力和生产性能，为绿色饲料添加剂，在水产养殖中，微生态制剂还能有效调控水质，是实现高效绿色养殖模式的有效措施之一[1]。

芽孢杆菌是一类重要的微生态制剂，可以形成芽孢，耐高温，具有较强的生存能力。在缺乏营养或不良环境时，芽孢杆菌可以生成芽孢来增强抗逆性进入消化道，调节肠道菌群，抑制病原菌生长。芽孢杆菌还能促进机体免疫器官及组织的成熟，可以促进淋巴细胞数量增加，从而提高机体的体液免疫、细胞免疫水平，芽孢杆菌在动物、人体的微生态调节中得到了高度重视和广泛应用，是较好的微生态制剂菌种[2]。刘文亮等在饲料中添加蜡样芽孢杆菌投喂凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），发现可以改变凡纳滨对虾的肠道微生物组成，提高其生长速度，增强其抗病能力[3]，将蜡样芽胞杆菌添加到凡纳滨对虾养殖水体中，可以提高凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）和感染能力[4]。孙盛明等在饲料中添加枯草芽孢杆菌，发现能够提高团头鲂幼鱼的生长性能、抗氧化能力并改变其肠道菌群结构[5]。张欢欢等在生物絮团对虾养殖系统中添加其分离到的芽孢杆菌，发现能够改善菌群结构，抑制弧菌生长[6]。芽孢杆菌、乳酸菌益生菌在卡他扇贝（Argopecten ventricosus）早期发育过程中能够促进卡他扇贝生长、抵抗溶藻弧菌病[7]。在饲料中添加枯草芽孢杆菌后，草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道和肝胰脏消化酶的活性显著提高，肠道芽孢杆菌、假单胞菌数量极显著提高，致病性弧菌、大肠秆菌数量极显著减少[8]。芽孢杆菌能产生胞外酶，如高蛋白酶、高淀粉酶活性，可以高效降解养殖残饵中的蛋白和淀粉，改善修复养殖环境。将芽孢杆菌类应用于水产养殖，进行水质调控，还可作为有害菌的拮抗菌替代或减少抗生素的使用。枯草芽孢杆菌 HAINUP40可显著降低水体中的亚硝酸盐、氨氮和化学需氧量，不仅可以作为水质改良剂改善水体环境，还可作为饲料添加剂提高罗非鱼的疾病抵抗力，预防无乳链球菌疾病的发生[9]。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）能够抑制多种水产病原菌，对水体环境的耐受能力强，具有防治水产养殖病原菌的应用潜力[10]。高艳侠等筛选的贝莱斯芽孢杆菌具有较强的广谱拮抗水产常见病原菌功能，能有效抑制水产养殖鱼类常见病原菌如无乳链球菌、 海豚链球菌等[11]。张皎皎等筛选的甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）对嗜水气单胞菌的抑制效果显著[12]。

有益微生物在水产养殖中能有效改善水质，其应用越来越广泛，但仍存在一些问题，如有些菌种的效果不高，稳定性差，不能快速成为优势菌群等[13]，微生态制剂菌种还具有种属特异性和地域性，一般从微生物生活的环境中分离和筛选特定功能益生菌，因此从相应的水产养殖环境分离菌株，用于筛选水产微生态制剂菌种更具有合理性[14-16]。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

2018年夏将池塘中零星死亡的鱼收集起来，在塘边煮成肉糜，任其自然发酵，待发酵肉汤无色无臭后，取回至北京市水产科学研究所实验室进行菌种分离。

1.2 培养基

1.2.1 营养琼脂培养基 10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠、2%琼脂粉，121 ℃高压灭菌 15 min ，倒平板上备用[17]。

1.2.2 产蛋白酶菌株筛选培养基 12 g/L脱脂奶粉、20 g/L营养琼脂，113 ℃高压灭菌15 min，倒平板上备用。

1.2.3 产淀粉酶菌株筛选培养基 可溶性淀粉 5 g/L、氯化钠5 g/L、pH值7.2，将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH值，加入2%琼脂粉，于115 ℃高压灭菌15 min，倒平板备用。

1.3 菌种分离

在无菌条件下，于灭菌后的三角瓶中加入 90 mL 无菌水和10 mL发酵肉汤，混匀后取10 mL悬浮液置于无菌试管中，在80 ℃保温15 min杀死非芽孢菌体，之后取1 mL进行梯度稀释制成悬液，浓度依次为发酵肉汤原液的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别取50 μL各稀释液涂布于营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h后，挑选单菌落，传代3次以上，待菌落稳定后，挑取单菌落用营养琼脂液体培养基在37 ℃、150 r/min下培養24 h，进行革兰氏染色、芽孢染色，在显微镜下观察，选取有芽孢的G+菌，灭菌甘油保存于-80 ℃。

1.4 生理生化鉴定

利用HIBacillusTM Identification Kit和参照微生物试验中的糖酵解试验进行鉴定。

1.5 分离纯化芽孢菌株产蛋白酶活力和产淀粉酶活力测定

挑选单菌落点种于“1.2.2”节所述培养基，于30 ℃恒温培养17 h，取出后4 ℃放置6 h，以芽孢杆菌利用底物产生透明圈直径和菌体直径的比值表示产酶活性。

挑选单菌落点种于“1.2.3”节所述培养基，于30 ℃恒温培养17 h，取出后4 ℃放置6 h，滴加鲁哥氏碘液显色，以芽孢杆菌利用底物产生透明圈直径和菌体直径的比值表示产酶活性。

1.6 分子生物学鉴定

挑选纯化的菌株参照曹凤明等的方法[17-18]设计引物，将纯化的菌株送北京擎科生物技术有限责任公司进行16S rRNA、gyrA、gyrB、rpoB、purH基因测序，测序引物序列见表1。

1.7 生长曲线的测定

将保存的芽孢杆菌在营养琼脂培养基平板上复苏，挑单克隆在LB培养基中于37 ℃、150 r/min过夜培养，将过夜培养的芽孢杆菌按1%的量接种于100 mL LB液体培养基中，于37 ℃、150 r/min振荡培养，每隔2 h使用伯乐（Bio-Rad）公司的SmartSpec Plus分光光度计检测菌液D600 nm，以测定D600 nm为纵坐标、以时间为横坐标绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

经过初筛、复筛，选取6株分离得到的菌株，将其编号为2019B1～2019B6，各菌株的菌落形态、革兰氏染色和芽孢产生情况见表2。

2.2 生理生化反应的鉴定

利用芽孢杆菌鉴定试剂盒HIBacillusTM Identification Kit的检测结果见表3，糖酵解试验结果见表4。

2.3 产淀粉酶、蛋白酶活性

用透明圈直径/菌落直径的值表示产酶能力[19]。由表5可以看出，6株菌株均具有产蛋白酶能力，其中2019B1和2019B6产蛋白酶能力最强;2019B2、2019B6无产淀粉酶能力，其他4株具有产淀粉酶能力，其中2019B5产淀粉酶能力最强。

2.4 分子生物学鉴定结果和系统发育树

将各菌株的16S rRNA核苷酸序列在GenBank中进行BLAST比对，发现每株都有多个与其同源性达99%以上的种，选取GenBank中与6株菌株同源性高的菌株的模式菌株的16S rRNA序列，用MEGA 6软件进行同源性比对并构建邻接（NJ）树，自展次数为1 000次（图1）。由系统发育树可见，2019B1与蜡样芽孢杆菌（B. cereus）聚为一支，2019B2与阿氏芽孢杆菌（B. aryabhattai）聚为一支，2019B3、2019B4与贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）聚为一支，2019B5、2019B6与解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）聚为一支。

除利用16S rRNA序列进行测序比对外，还对各菌株进行gyrA、gyrB、rpoB和purH基因的测序，并在GenBank中进行BLAST比对，发现2019B1的purH基因序列比对结果为蜡样芽孢杆菌，2019B3、2019B4的gyrA、purH基因序列的比对结果分别为贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，rpoB基因序列的比对结果均为贝莱斯芽孢杆菌，2019B5的gyrA基因序列比对结果为解淀粉芽孢杆菌，2019B6的rpoB、purH基因序列比对结果为解淀粉芽孢杆菌。

2.5 菌株鉴定结果

结合形态学、生理生化和分子生物学检测结果可知，2019B1为蜡样芽孢杆菌（B. cereus），2019B2为阿氏芽孢杆菌（B. aryabhattai），2019B3、2019B4为贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis），2019B5和2019B6为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。

2.6 生长曲线

由图2可以看出，6株芽孢杆菌均能在37 ℃的LB液体培养基中正常生长，达到较高浓度。其中，2019B2长势最好，培养13 h时已接近稳定期;2019B1、2019B2在培养2 h时就开始进入快速增长期， 在培养6.3 h后浓度增长放缓， 2019B1尤其明显;2019B4在培养4 h才开始生长，并逐渐结束迟缓期，在培养6.3 h进入快速生长期;2019B6的生长情况比较平稳，2019B3、2019B5的生长曲线比较一致，在培养4 h内和2019B6的长势相似，培养2 h内为迟缓期，培养2～4 h时生长开始增快，培养4 h后2019B3、2019B5快速增长，远远超过2019B6。

3 讨论与结论

枯草芽孢杆菌于1835年被正式命名，随着研究技术的进步，人们发现枯草芽孢杆菌是一个表型相似近缘种群（简称枯草群），其形态特征和生理生化特征是早期进行各种群分类与鉴定的基础，16S rRNA基因含有丰富的信息量，已经成为细菌系统发育和分类鉴定的标准，但是将分离筛选的菌株进行16S rRNA基因序列同源性检索时发现，多数菌株与GenBank数据库中几种芽孢杆菌的同源性达99%以上，这是因为枯草芽孢杆菌是一个表型相似近缘种群（简称枯草群），枯草群多个种类的16S rRNA基因序列相似性均在99.5%以上，目前NCBI（美国国家生物技术信息中心）核酸数据库中，16S rRNA、gyrB、gyrA、rpoB、 purH等基因已涵盖了枯草群的各个种，可利用这些基因进行相关菌株的鉴定和鑒别[18]，因此本研究在分离筛选芽孢杆菌时，不仅进行了生理生化鉴定，还进行了分子生物学鉴定，在进行分子生物学鉴定时除进行16S rRNA测序建树，各菌株还进行了gyrA、gyrB、rpoB和purH基因的测序同源比对，将传统方法与分子生物学方法相结合，互为补充和验证。

在生产过程中微生态制剂对于筛选益生菌尤其关键，种属特异性是筛选合适益生菌的一个先决条件，不同来源的芽孢杆菌在不同动物胃肠道内的黏附繁殖能力及相关生理功能有所不同[16]。水产养殖户在池边将零星死亡的鱼煮成肉糜自然发酵，待其无臭无味后泼洒使用，能有效地改善水质，池塘养殖鱼未出现不良反应，说明发酵后的鱼肉汤是安全的，可能含有能有效净化水质的微生物，从这种发酵的鱼肉汤中分离的菌株，可能来源于鱼体或周边环境，更适合在本区域池塘养殖使用。

本研究分离鉴定得到了6株芽孢杆菌，分属于4种，即1株蜡样芽孢杆菌，1株阿氏芽孢杆菌，2株解淀粉芽孢杆菌，2株贝莱斯芽孢杆菌，均具有产蛋白酶能力，其中4株具有产淀粉酶能力，6株菌在LB液体培养基中生长良好，为之后进一步研究其环境耐受性、体外抑菌试验、水质净化作用及对鱼类的免疫作用研究奠定了基础。

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