牛心朴子草总生物碱超声提取工艺及抑菌活性研究

景炳年 王伟 刘雨晴 谢晓阳 周雍 宁二娟 张华南 陈飞 魏磊

摘要：采用响应面法优化牛心朴子草总生物碱（TACKI）超声提取工艺，并研究其抑菌活性。以TACKI得率为研究指标，在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素进行Box-Behnken中心组合设计和响应面法分析，研究TACKI的最佳提取工艺条件;并分别采用倍比稀释和生长速率法研究TACKI对10 种常见致病细菌和9种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性。结果表明，TACKI最佳提取工艺条件为26倍量72%乙醇，53 ℃超声提取57 min，TACKI平均得率为0.492 8%，与模型预测值（0.493 1%）一致性好。TACKI可强烈抑制化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长，其最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均在 12.5 mg/mL 以下;在供试质量浓度100 mg/L时，TACKI对玉米弯孢病菌、苹果轮纹病菌、水稻稻瘟病菌和烟草赤星病菌菌丝生长均表现出较强的抑制作用，抑制率均在85%以上。优化得到的提取工艺稳定、简单、TACKI得率高，且TACKI具有较强的广谱抗菌作用。

关键词：牛心朴子草;生物碱;超声提取;抑菌作用;植物病原菌

中图分类号：R284   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）15-0163-08

收稿日期：2020-11-20

基金项目：河南省科学院基本科研项目（编号：200613027）。

作者简介：景炳年（1980—），男，甘肃武威人，博士，助理研究员，主要从事天然产物功能活性研究及农业绿色防控体系构建等。E-mail：stop328@163.com。

通信作者：魏 磊，博士，助理研究员，主要从事植物化学及分子生物学。E-mail：yhweilei2@163.com。

牛心朴子草（Cynanchum komarovii Al. Iljinski），别称老瓜头，为萝摩科鹅绒藤属有毒植物，主要分布于陕西、宁夏、甘肃、青海等我国北部的荒漠草原上，资源较丰富[1]。民间和藏医用牛心朴子草镇痛、杀虫、退烧、止泻、治疗胆囊炎等[2-3]，现代研究表明，牛心朴子提取物具有杀虫[4～8]、抗菌[9-10]、抗植物病毒[11-13]、抗肿瘤[14]、抗氧化[15]、除草[16]、镇痛抗炎[17-19]、止咳、祛痰及平喘[20]、增强免疫力[21]等多种生物活性，开发潜力巨大。

牛心朴子草所含化學成分种类繁多，主要包括：C21-甾体糖苷、生物碱、萜类、黄酮醇类、多糖等[22-28]。目前，对牛心朴子草化学成分的研究主要集中在C21-甾体糖苷、生物碱。研究表明，牛心朴子草总生物碱（TACKI）与牛心朴子草广泛而显著的生物活性息息相关[31-52]，TACKI主要为7-脱甲氧基娃儿藤碱（7-demethoxylophorine，DEM）、（13aR，14R）-14-羟基-7-脱甲氧基娃儿藤碱、（13aR，14R）-14-羟基-7-脱甲基娃儿藤碱氮氧化物、氧化脱氧娃儿藤次碱、去羟娃儿藤宁、娃儿藤宁、N-氧化-7-脱甲氧基娃儿藤碱、娃儿藤碱、6-羟基-2，3-二甲氧基菲骈吲哚里西啶等[52]，这些生物碱结构主要为菲骈吲哚里西啶类生物碱[53]。

TACKI在牛心朴子草中的含量较低[53]，因此TACKI提取工艺研究就成为牛朴心子草开发利用的关键。万清玉等以正交试验建立了甲醇超声提取牛心朴子草中7-脱甲氧基娃儿藤碱的最佳提取工艺[54];郭金玲等研究了不同提取剂及其操作条件对总生物碱提取率的影响[55];米海莉等考察了提取溶剂浓度和提取方法对TACKI提取量影响以及絮凝剂对总生物碱精制条件[56];李玉美等研究了大孔吸附树脂吸附和分离TACKI的方法和条件[57];这些研究多限于对TACKI的分离精制工艺或7-脱甲氧基娃儿藤碱等特定成分的提取，对TACKI提取的研究也主要集中在提取溶剂、提取方法或单个参数的研究上，但目前尚未见利用响应面法优化TACKI提取工艺，并研究其抑菌活性的报道。本研究拟采用响应曲面方法（response surface methodoloy，RSM）对牛心朴子草中TACKI提取工艺参数进行优化，以确定最佳提取工艺;并对所提取的TACKI进行常见致病细菌和植物病原真菌抑制活性研究，以期为该植物资源的充分、合理开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛心朴子草于2018年10月采自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗，晒干粉碎后备用;大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）ATCC 19615、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 13311、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）ATCC 49619、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC 700603，7株试验菌株冻干菌种购自南京便诊生物科技有限公司;粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、都柏林沙门氏菌（Salmonella dublin）、烟草赤星病菌[Alter aria alternate （Fries）Keissler]、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae Cav.）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola Nose）、白菜黑斑病菌（Alternaria raphani Groves）、玉米弯孢病菌[Curvularia lunata （Walk） Boed]、南瓜枯萎病菌（Fusarium bulbigenum）、马铃薯干腐病菌[Fusarium solani （Mart.）]、棉花枯萎病菌（Cotton Fusarium Wilt）12种供试菌株，由河南省科学院天然产物重点试验室提供;胰蛋白胨（上海宝录生物科技有限公司）、牛肉浸膏（北京双旋微生物培养基制品厂）、微量MIC测定板（美国Corning公司）、琼脂粉（青岛海博生物）、无水乙醇、盐酸、氯仿、无水Na2SO4（均为北京化工厂生产），以上试剂均为分析纯。

KQ-500E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、YJ-VS-2型超净工作台（无锡一净净化设备有限公司）、ME-204型电子天平（美國Mettler公司）、EYELA N-1100型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）、TU-1810型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、SYQ-DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、DHP-9082型电热恒温培养箱（上海红华仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 牛心朴子草粗粉的制备

将晒干的牛心朴子草放入50 ℃恒温干燥箱内24 h，粉碎过40目筛得到牛心朴子草粗粉，备用。

1.2.2 TACKI的提取工艺[46]

精确称取牛心朴子草10 g于100 mL锥形瓶中，加溶剂超声辅助提取，重复3次，合并滤液浓缩，获得乙醇浸膏。取乙醇浸膏，按质体比1 ∶1溶解于2%盐酸水溶液中，将不溶物滤出，再用乙酸乙酯（3倍盐酸体积）萃取3次后，采用氨水将水相调至pH值为9～10，再用氯仿（3倍盐酸体积）萃取，萃取至碘化铋钾反应成阴性，合并萃取液再经无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂后，于50 ℃的干燥至恒质量，即得TACKI。单因素试验和响应面试验中TACKI的提取均按照此工艺方法进行。并按照下式计算各处理总生物碱的得率：

总生物碱得率=m0m1×100%。（1）

式中：m0为TACKI的质量;m1牛心朴子草粗粉的质量。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 不同乙醇浓度对总生物碱得率的影响

以料液比1 g ∶20 mL比例分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，在50 ℃下超声提取30 min，考察乙醇浓度对TACKI得率的影响。

1.2.3.2 不同料液比对总生物碱得率的影响

分别以1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）料液比加入70%乙醇溶液，在50 ℃下超声提取间30 min，考察料液比对TACKI得率的影响。

1.2.3.3 不同超声温度对总生物碱得率的影响

以料液比1 g ∶20 mL比例加入70%乙醇溶液，分别在20、30、40、50、60、70 ℃温度下提取30 min，考察提取温度对TACKI得率的影响。

1.2.3.4 不同超声时间对总生物碱得率的影响

以料液比1 g ∶20 mL比例加入70%乙醇溶液，在50 ℃温度下分别提取20、30、40、50、60 min，考察超声时间对TACKI得率影响。

1.2.4 响应面试验

在上述单因素试验的基础上，以总生物碱得率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6统计分析软件，设计4因素3水平共29个点进行试验，各因素设计水平见表1。

1.2.5 TACKI对细菌抑制活性测定

采用倍比稀释法[58]测定TACKI的最小抑菌浓度（MIC）。将TACKI配制成200 mg/mL初始溶液，采用 0.22 μm滤膜过滤，为样品原液，再将样品原液倍比稀释成100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL 8个浓度。将母液及稀释药液依次加入MIC板中，每孔0.1 mL;再分别加入已稀释好的各种菌液，每孔0.1 mL，并设置阳性对照（加入 0.1 mL 菌液和0.1 mL液体培养基）和阴性对照（只加液体培养基）。将制备好的MIC板放入37 ℃恒温箱中培养24 h，观察生长情况，以完全没有细菌生长的TACKI最小浓度为其最小抑菌浓度（MIC）。将无细菌生长的各孔样品分别涂布于固体培养基上，37 ℃继续培养24 h，观察结果，以仍不长菌的最低浓度为TACKI的MBC。

1.2.6 TACKI对植物病原真菌菌丝抑制活性测定

采用生长速率法测定TACKI对供试植物病原真菌菌丝生长的抑制活性。将TACKI配制成初始质量浓度为1 000 mg/L的溶液，采用0.22 μm滤膜过滤，即为样品母液。在无菌条件下取1 mL母液于 10 mL 刻度试管内，对照组加入1 mL无菌水，再倒入融化的PDA培养基定容至10 mL（即平板内TACKI浓度为100 mg/L），摇匀后趁热倒入培养皿内。选取处于同一生长势的菌落圈，采用打孔器（直径4 mm）制得菌饼，倒置于上述已制备好的平皿上，菌丝面朝下接入平板，每皿1个菌饼，每个处理重复3次，28 ℃恒温倒置培养72 h。采用十字交叉法测量菌落直径，按公式（2）和公式（3）计算抑制率。

菌落直径（mm）=测量直径（mm）-4.0;（2）

菌丝生长抑制率=对照组菌落直径-处理组菌落直径对照组菌落直径×100%。（3）

上述所有试验于2020年4月至10月在河南省科学院天然产物重点试验室完成。

1.3 数据处理

运用Origin 7.5软件绘制单因素试验数据趋势曲线图，采用 Design-Expert 8.0.6 软件进行响应曲面试验设计与分析，所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同乙醇浓度对TACKI得率的影响

由图1可知，乙醇浓度对TACKI得率影响比较大，总生物碱得率随乙醇浓度的升高而逐渐增加，乙醇浓度达70%后逐渐平稳，且乙醇浓度为70%时，总生物碱得率最高，说明TACKI在70%左右乙醇中溶解度最大，当乙醇浓度在70%以上时，会有一些醇溶性杂质、色素及亲脂性强的成分溶出，影响TACKI的提取。故选取70%乙醇为生物碱最佳提取浓度。

2.1.2 不同料液比对TACKI的影响

由图2可知，料液比对TACKI得率的影响也比较大，TACKI的提取效果随料液比的增加而增大，且增幅較为明显，主要是因为在一定范围内溶剂用量的增加，有助于生物碱的浸出。当液料比为1 g ∶25 mL时，TACKI得率最高，继续增大料液比时，生物碱提取量略有下降，这可能是由于TACKI的溶出在液料比1 g ∶25 mL时已达到饱和状态，因此液比以 1 g ∶25 mL 为宜。

2.1.3 不同超声温度对TACKI得率的影响

由图3可知，TACKI提取效果随温度呈先显著增加后略有降低的趋势，50 ℃时提取效果最好。这是因为温度升高降低了液体黏度，加快了分子的运动速度，导致总生物碱类物质快速溶出，但随着温度继续升高，部分热稳定性小的生物碱也会随之分解，同时也会增加杂质的溶出，进而影响TACKI的得率，所以选超声温度在50 ℃为宜。

2.1.4 不同超声时间对TACKI得率的影响

由图4可知，50 min时，TACKI得率达到最高，此后逐渐降低。说明在提取约50 min时，牛心朴子草粗粉与提取溶剂充分接触，总生物碱已充分溶出;继续增加提取时间，可能会导致部分生物碱的分解和加大杂质的溶出量，从而降低了生物碱的提取率，故生物碱的最宜提取时间为50 min。

2.2 响应曲面法优TACKI的提取工艺

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据Box-Behnken中心组合设计原理，本试验共进行29个点的响应面试验，响应面试验设计和试验结果见表2。

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

采用Design-Expert 8.0.6软件得到TACKI得率（Y）与各因素之间的二次多项回归模型为：Y=0.48+0.02A+0.019B+7.408×10-3C+0.02D+0.015AB+2.5×10-4AC+8.45×10-3AD+9.525×10-3BC+0.012BD-5.9×10-3CD-0.065A2-0.061B2-0.01C2-0.018D2。

由表3可知，该回归模型极显著（P<0.000 1）;失拟项不显著（P=0.787 1>0.05），表明该模型拟合程度良好;模型的相关系数R2=0.975 3，说明总生物碱得率的变化有97.53%来自于所选试验因素，因此该模型与实际试验模拟合度较好;校正决定系数R2Adj=0.950 6，表明生物碱得率95.06%的变异分布在方程中。

回归方程各项方差表明，一次项A、B、D极显著（P<0.01），C显著（P<0.05）;二次项A2、B2、D2极显著（P<0.01），C2显著（P<0.05）;交互项中仅BD达到显著水平，综合各项方差分析结果可知，各具体试验因子对TACKI得率的影响不是简单的线性关系。试验因素系数的F值越大则表明该因素对响应值的影响越大，因此影响TACKI得率由大到小的因素为D>A>B>C，即超声时间>乙醇浓度>料液比>超声温度。

2.2.3 响应面交互作用分析

由图5可知，各响应面图均为开口向下的凸形曲面，说明响应值均存在极大值，即在本试验所设计的因素水平范围之内可以获得TACKI最优提取参数。

根据回归模型分析可知，TACKI超声辅助提取的最优提取工艺为：乙醇浓度72.3%、料液比 1 g ∶26.3 mL、超声温度 53 ℃、超声时间 56.6 min，此条件下，TACKI得率的理论预测值为 0.493 1%。结合生产实际，将各因素进行调整为乙醇浓度72%、料液比1 g ∶26 mL、超声温度 53 ℃、超声时间57 min，在此条件下重复试验 3 次，实际测得的TACKI平均得率为 0.492 8%，与预测值基本吻合，表明本试验利用响应曲面法优化得到的数学模型可靠，具有良好的预测性，由该模型优化得出的工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

2.3 抑菌试验结果

2.3.1 对致病细菌抑制活性测定结果

由表4可知，TACKI对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、和化脓性链球菌抑制作用最强，最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均在12.5 mg/mL以下。但对肺炎克雷伯氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌在供试浓度下无抑制作用。

2.3.2 对植物病原真菌菌丝抑制活性测定结果 由表5可知，在供试质量浓度100 mg/L时，TACKI对9种农业植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用，抑制率均在62%以上，其中对玉米弯孢病菌、苹果轮纹病菌、水稻稻瘟病菌和烟草赤星病菌菌丝生长均表现出较强的抑制作用，抑制率均在85%以上。

3 讨论与结论

本试验在单因素试验基础上，采用响应面分析法确定了TACKI超声辅助的最优提取工艺为乙醇浓度72%、 料液比1 g ∶26 mL、 超声温度53 ℃、超声时间57 min，在此优化条件下，TACKI平均得率为0.492 8%，与模型预测值（0.493 1%）一致性良好，说明此优化工艺稳定可行，可为TACKI工业化生产提供指导。生物碱是牛心朴子草的主要活性成分，但其在牛心朴子草全株中的含量较低，因此TACKI提取分离就成为牛朴心子草开发利用的关键。国内外学者已在TACKI提取分离方面做了大量研究工作，但在TACKI得率方面的差异很大，目前文献报道的TACKI最高达3.83%[52]，最低0.096%[59]，导致TACKI得率差异较大的原因主要在于以下几点：（1）提取工艺参数（如溶剂、方法、时间、次数及提取仪器的功率等）的不同导致TACKI得率的差异，目前文献报道的TACKI提取溶剂有不同浓度的乙醇[54]、甲醇[60]、不同pH值的工业乙醇及不同盐酸浓度的酸水[55]，提取方法包括超声[46]、微波[53]、热回流、渗漉、温浸、煎煮等[56]，其中应用最多的溶剂为乙醇、方法为超声波辅助提取;（2）不同的分离富集过程导致TACKI得率的差异，TACKI分离富集主要采用溶剂萃取[50]、大孔吸附树脂吸附分离[57]、絮凝剂絮凝[56]等方法，每种方法中具体参数的差异也会导致TACKI得率的差异;（3）检测方法的不同导致TACKI得率的差异，目前文献报道的TACKI的检测方法主要有重量法[46]、酸碱滴定法[56]、紫外分光光度法[55]及GC-MS分析法[59]，这些检测方法在检测TACKI含量方面的精密度、准确度等尚未进行研究。此外，牛心朴子草产地、采摘季节、提取部位及粉碎粒度也会对TACKI得率造成一定的影响。

TACKI显示出了较强的广谱抗菌作用，对多种致病细菌，如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌等[9]，多种农业植物病原真菌，如烟草赤星、马铃薯干腐、小麦根腐、玉米大斑、番茄灰霉、稻瘟病及尖孢镰刀菌等[10，31]病原菌均具有较好的抑制作用。本研究也表明TACKI提取物具有广谱的抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和化脓性链球菌最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均在12.5 mg/mL以下;在供试质量浓度100 mg/L时，对玉米弯孢病菌、苹果轮纹病菌、水稻稻瘟病菌和烟草赤星病菌菌丝生长均表现出较强的抑制作用，抑制率均在85%以上。因此，TACKI的杀菌活性值得进一步深入研究。

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