浙江蜡梅叶片的活性成分及其抗氧化能力

摘要：为了明晰浙江蜡梅叶片的活性成分，进一步挖掘其生物活性，以其叶片为材料，采用不同溶剂提取其活性成分，并进行成分的系统定性、定量（多糖、多酚、黄酮）和抗氧化活性研究。结果表明，浙江蜡梅叶片活性成分类别丰富，含有酚类、多糖、黄酮、生物碱等多种成分。定量结果表明，不同提取物间多糖、多酚、黄酮含量差异显著，其中甲醇提取物中多糖、多酚、黄酮含量均最高，分别为41.82、23.25、18.40 mg/g。抗氧化活性结果表明，不同提取物均具有良好的抗氧化活性，其中甲醇提取物在清除DPPH自由基、还原力方面的能力均最强，其IC50值分别为25.02 μg/mL、0.24 mg/mL。综合分析可知，浙江蜡梅叶片含有多种活性成分并具有抗氧化活性，是良好的药用植物。

关键词：浙江蜡梅;活性成分;定性;定量;抗氧化活性

中图分类号： R284.1  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）15-0159-04

收稿日期：2021-03-17

基金项目：福建省自然科学基金（编号：2016J05041）;福建省教育厅中青年教师教育专项科研项目（编号：JAT160526、JA15544）。

作者简介：陈建烟（1986—），女，福建仙游人，博士，讲师，主要从事天然产物研究与开发利用方面的工作。Tel：（0593）2955055;E-mail：jieandyanheart@126.com。

浙江蜡梅（Chimonanthus zhejiangensis M.C.Liu）为蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus Lindl.）植物，主要分布于浙江南部及福建北部等地，具有优良的药用价值，是重要畬药食凉茶的来源植物之一[1-3]。畬药食凉茶采用浙江蜡梅、柳叶蜡梅（C. salicifolius S.Y.Hu）的叶片及嫩芽制作而成，常用于治疗感冒、消化不良、小儿疳积、腹泻、醒酒、解暑、伤食所致的痞满证和慢性胃炎及十二指肠溃疡引起的胃胀、胃痛、泛酸等，其用药历史悠久、疗效确切、副作用少，是应用最广的畬药之一[4-6]，畲民也常作茶水饮用。近些年的研究发现，畬药食凉茶还具有解热镇痛、抗菌、抗病毒、抗炎、镇咳、增强免疫、减肥及降血压等功效[7-8]。食凉茶的药效与其所含成分密切相关，但目前关于其活性成分及药效的研究多集中在柳叶蜡梅上，而少见关于浙江蜡梅的研究。已有研究发现，柳叶蜡梅含有挥发油、酚类、黄酮类、香豆素类、蛋白质及氨基酸、脂肪、纤维、可溶性糖、维生素等成分[9-12]，而目前对浙江蜡梅活性成分的研究多集中于挥发油和黄酮类化合物上[1-2，13]，缺乏对其他成分的系统定性分析及对其多酚、多糖、黄酮等活性成分的定量分析。

目前针对浙江蜡梅生物活性的研究极少，只有少量研究发现，其叶片挥发油及水提取物具有抗菌活性，其花提取物具有抗氧化活性[13-15]，但目前关于其叶片抗氧化活性的研究还未见报道。浙江蜡梅以叶片入药，叶片是其重要的药用部位。因此，本研究采用不同极性溶剂对浙江蜡梅叶片成分进行提取，并对不同提取物进行成分系统定性、定量和抗氧化活性分析，旨在探明浙江蜡梅叶片的活性成分，进一步挖掘其生物活性，从而为浙江蜡梅的功效拓展及深度开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本试验于2017年1—3月在宁德师范学院生物实验中心进行。试验材料为浙江蜡梅叶片，于2017年1月采自福建省宁德市寿宁县，经宁德师范学院陈勇教授、刘凯良讲师共同鉴定为浙江蜡梅。挑选无病新鲜叶片，洗净后冻干粉碎，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

试验试剂：三氯化铁、盐酸、硅钨酸、氢氧化钠、Tollens 试剂、冰醋酸、浓硫酸、茚三酮、溴酚蓝、甲醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、葡萄糖、福林酚、没食子酸、芸香苷、抗坏血酸（维生素C）、铁氰化钾、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-dipheny-1-picryl hydrazyl，简称DPPH，Simga-Aldrich公司），除DPPH外其他试剂均为国产分析纯，试验用水均为超纯水。

试验仪器：旋转蒸发仪（日本EYELA公司，N-1100D-W）、超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司，scientz-ⅡD）、电子天平（赛多利斯公司，SQP）、恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司，HH-2）、分光光度計（日本岛津公司，UV2550）、冷冻干燥机（日本EYELA公司，FDU-2011）、中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司，FW177）等。

1.2 试验方法

1.2.1 不同提取物的制备 精确称取处理好的浙江蜡梅叶片干粉各50 g于样品瓶中，分别加入500 mL超纯水、95%甲醇、乙酸乙酯、石油醚，于摇床振荡提取24 h（30 ℃、120 r/min），再超声提取2 h（300 W、30 ℃），过滤除去滤渣，即得不同提取液。将提取液干燥后磨成粉，即得不同提取物，按下式计算提取物得率：

提取物得率=提取物质量（g）浙江蜡梅叶片干粉质量（g）×100%。

1.2.2 浙江蜡梅叶片成分的系统定性分析 参考展锐的方法[16]，采用化学预试法对不同提取物进行成分的系统定性分析。

1.2.3 浙江蜡梅叶片成分的定量分析 根据定性分析结果，对不同提取物进行多糖、多酚及黄酮化合物的定量分析，其中多糖含量采用苯酚-硫酸法[17]测定，多酚含量参照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[18]测定，黄酮含量采用Al（NO3）3-NaNO2比色法[19]测定。

1.2.4 浙江蜡梅叶片抗氧化活性的测定 采用清除DPPH自由基和还原力的方法[20]测定不同提取物的抗氧化活性并计算IC50值（清除率/吸光度=50%/0.5时的样品浓度），以抗坏血酸为阳性对照。

1.2.5 数据分析 每组试验重复3次，结果表示为“均值±标准差”，试验数据采用SPSS 18.0软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取物的提取得率

由表1可以看出，采用不同溶剂对浙江蜡梅叶片进行成分提取，各提取物得率间差异显著，其中甲醇的得率最高，为27.20%，提取得率最低的为石油醚，为2.95%。这可能是由于浙江蜡梅中不同成分的含量不同，而不同极性的溶剂能够提取的成分类别及含量不同，因此提取得率间差异显著。

2.2 浙江蜡梅叶片成分定性与定量结果分析

2.2.1 成分系统定性分析 对不同提取物进行成

分的系统定性分析，结果（表2）表明，在鉴识的13种成分类别中，浙江蜡梅叶片含有12种，其中甲醇、水、乙酸乙酯和石油醚提取物分别检出8、8、7、7种成分，且甲醇与水提取物、乙酸乙酯与石油醚提取物两两所含成分较为相似。这可能是因为其两两溶剂极性较为相近，因此能够溶解提取的物质较为相似。在试验浓度下，4种提取物中均检出了酚类、糖/多糖及其苷类、挥发油及油脂类和有机酸4类成分，而均未检出氨基酸、多肽和蛋白质类。同类别成分可能因为含有多种化合物而具有不同溶解性，因此可以溶解于不同溶剂中而被检出。由于本试验采用化学预试法，检测结果可能由于灵敏度不够高及提取物本身的颜色干扰而导致一些含量较低的成分未能被精确检出[19]。成分定性结果表明，浙江蜡梅叶片活性成分类别丰富，值得深入研究。

2.2.2 成分定量分析 对不同提取物中多糖、多酚、黄酮类化合物总含量进行测定，结果（表3）表明，不同提取物中同类成分的含量差异显著，甲醇提取物中多糖、多酚、黄酮3种成分含量均最高，分别为41.82、23.25、18.40 mg/g，而石油醚提取物中多糖、多酚、黄酮3种成分含量均最低，分别为5.59、3.06、9.62 mg/g。在甲醇提取物中，这3类成分的含量最高，可能由于浙江蜡梅叶片中这几类化合物的极性较大，因此更易在甲醇中溶解浸出。多糖、多酚和黄酮是重要的植物活性成分，在浙江蜡梅叶片中，这几类活性成分的含量较高，揭示其可能具有丰富的生物活性，值得深入挖掘。

2.3 浙江蜡梅不同提取物性能分析

2.3.1 不同提取物对DPPH自由基的清除率 由图1可以看出，不同提取物对DPPH自由基都具有很强的清除能力，且清除率随着浓度升高而升高，在本试验中的最高浓度条件下，甲醇提取物（0.1 mg/mL）、水提取物（0.2 mg/mL）、乙酸乙酯提取物（0.2 mg/mL）、石油醚提取物（4.0 mg/mL）的清除率分别为85.67%、91.19%、90.67%、90.77%。总体上看，石油醚提取物清除DPPH自由基的效果弱于其他三者，而所有提取物的效果都稍弱于阳性对照抗坏血酸。植物多糖、多酚及黄酮类成分通常具有很强的抗氧化活性，在石油醚提取物中这3种成分含量较低，可能是由于其对DPPH自由基的清除能力弱于其他提取物。

2.3.2 不同提取物的还原力 由图2可以看出，甲醇提取物、水提取物和乙酸乙酯提取物具有较强的还原力，其还原力随着浓度的上升而急剧升高，石油醚提取物的还原力相对较弱，随着浓度升高，还原力上升较慢;但几种提取物的还原力都稍弱于阳性对照抗坏血酸。不同提取物的还原力与其所含成分及成分间的相互作用密切相关，不同提取物的还原力强弱与其中多糖、多酚和黄酮含量高低结果相符，说明这几种成分可能是其还原力的重要组成成分。

2.3.3 不同提取物的IC50值 由表4可以看出，在清除DPPH自由基方面，甲醇提取物（25.02 μg/mL）和水提取物（45.20 μg/mL）效果优越，其IC50值虽然高于抗坏血酸，但三者之间的差异不显著;而石油醚提取物的IC50值最高，其清除DPPH自由基的能力最弱。在还原力方面，不同提取物的效果差异显著，甲醇（0.24 mg/mL）的效果最优，石油醚（2.36 mg/mL）的效果最差，但它们的IC50值均显著高于阳性对照抗坏血酸，说明不同提取物虽然还原力较强但仍然低于抗坏血酸。综合比较发现，浙江蜡梅叶片提取物具有较好的抗氧化能力，但其清除DPPH自由基的能力优于还原力。

3 结论与讨论

采用甲醇、水、乙酸乙酯、石油醚4种溶剂提取浙江蜡梅叶片的活性成分，并进行系统定性、定量分析。结果显示，浙江腊梅叶片所含成分类别丰富，在所检测的13种成分中，除氨基酸、多肽和蛋白质类外，浙江蜡梅叶片含有包括酚类、糖类、黄酮类、香豆素类、生物碱、皂苷、挥发油及油脂类等在内的12种成分，其在成分类别上与同药源植物柳叶蜡梅相似[21]。本研究未检测浙江蜡梅叶片中的脂肪、维生素及矿质元素等成分，留待后续研究。柳叶蜡梅叶片含有氨基酸及蛋白質类，这与本研究结果有差异，可能是由于检测溶液浓度过低或提取、检测手段差异导致的。在成分定量分析方面，甲醇提取物在多糖、多酚和黄酮类成分含量上均最高，且其提取得率也最高，揭示其可能是提取浙江蜡梅叶片活性成分的优良溶剂。本研究仅对多糖、多酚和黄酮总含量进行测定，后续可对每种成分类别中的具体化合物进行分离测定，明确每种成分类别的构成及含量，以进一步比较不同溶剂提取效果的优劣。与柳叶蜡梅相比，浙江蜡梅叶片中的黄酮含量更高，但多酚含量更低[12，22-23]，这种差异除了由于植物特性上的差异外，还可能与提取溶剂、方法等不同有关。

本研究结果表明，浙江蜡梅叶片具有良好的抗氧化活性，其甲醇提取物在清除DPPH自由基和还原力方面均较其他提取物优越，其IC50值分别为25.02 μg/mL、0.24 mg/mL。除了石油醚提取物外，浙江蜡梅叶片其他3种提取物在清除DPPH自由基方面优于柳叶蜡梅;但在还原力方面，除了甲醇提取物外，浙江蜡梅叶片其他3种提取物均弱于柳叶蜡梅[12，23]。由此可见，在抗氧化活性方面柳叶蜡梅与浙江蜡梅各有优劣，这可能与两者所含抗氧化成分（如多酚、黄酮等）类别、含量不同有关。浙江蜡梅叶片提取物具有良好的抗氧化活性，但具体是哪些成分类别、同一类别中的哪些化合物及其结构、含量等发挥作用还未可知，其机制有待进一步研究明确。除了抗氧化活性外，已有研究发现，柳叶蜡梅还具有抗癌、抑菌、肝损伤保护等作用[11-12，24-25]，但关于浙江蜡梅生物活性方面的研究还较少。综合比较两者成分类别相似，浙江蜡梅可能也具有上述生物活性，今后可进行相关方面的研究。

综上所述，浙江蜡梅叶片含有多种活性成分，具有良好的抗氧化活性，是一种极具开发潜能的植物材料，并可能具有其他多种重要的生物活性，具体有待深入研究，具有广阔的研究应用空间。

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