鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定

韩凯凯 严若峰 刘青涛 刘宇卓 李银 赵冬敏 黄欣梅 杨婧

摘要：甲基转移酶（methyltransferase，MTase）是鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）非结构蛋白5的重要功能基团，在病毒复制及致病过程中发挥重要作用。为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达，并对其生物学功能进行鉴定，以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板，设计针对MTase的特异性引物，提取TMUV RNA，反转录得到cDNA，以其为模板进行扩增，得到MTase的基因片段，然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中，构建重组质粒pCMV-Flag-MTase，提取去除内毒素的重组质粒，并转染至BHK-21细胞，通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达。结果显示，质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确，通过间接免疫荧光与Western Blot检测，重组质粒在BHK-21细胞内正常表达，表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性。

关键词：鸭坦布苏病毒;甲基转移酶;真核表达

中图分类号：S852.65+7   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）15-0147-03

收稿日期：2020-12-16

基金项目：国家自然科学基金（编号：31502101）;江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（20）3093]。

作者简介：韩凯凯（1983—），男，河南新乡人，博士，副研究员，主要从事水禽疫病防控相关研究。E-mal：hankk0917@126.com。

坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，通过节肢动物的叮咬进行传播而导致宿主发病，主要引起20日龄以内的雏鸭出现严重的神经症状，死淘率增高及产蛋鸭的产蛋大幅下降[1]。坦布苏病毒基因组是单股正链RNA，含有一个大型开放阅读框，可编码7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）和3种结构蛋白（C、PM和E）[2]。NS5在这几种蛋白中分子量是最大的，大约100 ku，整个NS5蛋白具有2个功能域，分别是N端的甲基转移酶结构域和C端的RNA依赖的聚合酶结构域。NS5蛋白甲基转移酶功能基团同时具有N-7和2′-O这2种甲基化功能，可以催化病毒遗传物质RNA的5′端形成一型的RNA帽子[3]，这一帽子结构对病毒具有重要作用，可以防止病毒遗传物质被宿主细胞内的核酸外切酶降解，辅助病毒完成免疫逃逸。

目前，在黄病毒属其他病毒，如登革病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、寨卡病毒上均有甲基转移酶的相关报导[4-5]，但在鸭坦布苏病毒上却鲜有研究。本研究构建了鸭坦布苏病毒甲基转移酶基因的真核表达系统，并在哺乳动物细胞中高效表达MTase重组蛋白，旨在為进一步研究其功能、研发坦布苏病毒病的诊断、治疗方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和载体

坦布苏病毒分离株（JS804）、BHK-21细胞株、真核表达载体pCMV-Flag，均由笔者所在实验室保存。E.coli DH5α感受态细胞，购于TaKaRa公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体、T4 DNA连接酶、蛋白质相对分子质量标准等，购自宝生物工程（大连）有限公司;体液病毒RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒，购自Axygen生物科技有限公司;脂质体转染试剂lipofectamine 3000，购自Invitrogen公司;FITC标记的山羊抗小鼠IgG，购于碧云天公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，购于中杉金桥公司;DMEM细胞培养基、胎牛血清，购自Gibco公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中登录的坦布苏病毒JS804株（GenBank登录号JF895923） NS5基因序列，设计PCR 扩增引物，其中上游引物为MTase-F：5′-CAGGGACCCTCGAGATGGGAGGGGGAACT-3′，划线部分为引入的XhoⅠ酶切位点。下游引物为MTase-R：5′-CCAAGTCTTCCGCGGATTGTCTTGGTCAT-3′，划线部分为引入的SacⅡ酶切位点。以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，预期扩增片段大小为900 bp。

1.4 DTMUV MTase基因的扩增

按照Axygen公司体液病毒RNA提取试剂盒要求提取DTMUV JS804株的总RNA，并按照反转录试剂盒操作说明书，合成反转录产物cDNA。以cDNA为模板，MTase-F和MTase-R为引物进行PCR扩增。扩增体系（25.0 μL体系）：其中双蒸水15.0 μL，10×Ex PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物（25.0 pmol/μL）各1.0 μL，cDNA产物1.5 μL，Ex Taq （5 U/μL） 0.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30 次循环;72 ℃总延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后按照琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒操作说明进行产物回收纯化。回收的片段按照pMD19-T载体说明书进行连接，构建重组克隆质粒，并转化至DH5α感受态细胞中，经LB固体培养基37 ℃倒置过夜培养后，挑取单菌落振荡培养3 h，并对菌液进行PCR鉴定。鉴定正确的菌液取500 μL送至南京生工生物科技有限公司进一步测序，鉴定正确后按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒。

1.5 重组质粒pCMV-Flag-MTase的构建

用XhoⅠ、SacⅡ对重组克隆质粒及pCMV-Flag载体双酶切，电泳切胶回收，将2种酶切后回收的片段按照适宜比例与T4 DNA 连接酶16 ℃连接过夜。连接产物转化至DH5α 感受态细胞中，涂布于卡那霉素的平板，37 ℃倒置过夜培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，鉴定正确的菌液扩大培养后提取质粒，用XhoⅠ、SacⅡ进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送至南京擎科生物科技有限公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pCMV-Flag-MTase。

1.6 BHK-21细胞的转染

按照质粒小量提取试剂盒要求提取pCMV-Flag-MTase，分光光度计测定其浓度。取处于对数生长期的BHK-21细胞，接种24孔细胞培养板，细胞铺至细胞板约90%时进行转染。按照lipofectamine 3000转染试剂操作说明书制备DNA-脂质体混合物，其中转染的DNA用量为2.5 μg。混匀后室温孵育20 min，将DNA-脂质体混合物均匀铺到细胞中。

1.7 间接免疫熒光鉴定

取质粒pCMV-Flag-MTase转染24 h后的BHK-21细胞，PBS洗涤3次，采用4%多聚甲醛固定细胞10 min;PBS洗涤3次，每次5 min，采用0.5% triton X-100对细胞透化处理10 min;PBS洗涤3次，5 min/次，加入1% BSA，室温封闭30 min;PBS洗涤3次，5 min/次，然后加入事先制备的坦布苏病毒阳性小鼠血清（1 ∶1 000），室温孵育1 h，PBS洗涤3次，5 min/次，最后加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1 ∶400），室温孵育30 min，PBS洗涤3次，5 min/次，倒置荧光显微镜下观察，照相记录。

1.8 Western Blot鉴定

pCMV-Flag及pCMV-Flag-MTase分别转染BHK-21细胞，48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后经Western Blot检测该蛋白的表达情况。先进行SDS-PAGE电泳，再经转膜、封闭，然后以抗坦布苏病毒阳性小鼠血清体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG为二抗进行反应，ECL显影观察结果。

2 结果与分析

2.1 鸭坦布苏病毒MTase基因的PCR扩增

由图1可知，以含有鸭坦布苏病毒JS804株全长基因的cDNA为模板，采用所设计的特异性引物扩增MTase基因全长，结果扩增的片段大小约为900 bp，与预期片段大小相符。

2.2 重组质粒pCMV-Flag-MTase的PCR和双酶切鉴定

由图2可知，菌液PCR结果显示，挑取的单克隆均为阳性，可扩增得到与MTase大小一致的DNA片段。利用XhoⅠ、SacⅡ对重组质粒pCMV-Flag-MTase进行双酶切，结果显示出现2条特异性的条带，一条大小约为4 300 bp，为pCMV-Flag载体条带，另一条大小为900 bp，与MTase大小一致。测序结果显示，MTase基因序列与GenBank发布的序列同源性达99%。结果表明真核质粒pCMV-Flag-MTase构建成功。

2.3 重组质粒pCMV-Flag-MTase的转染效果

采用脂质体转染试剂lipofectamine 3000介导pCMV-Flag-MTase转染至BHK-21细胞，24 h固定间接免疫荧光检测表达情况。通过倒置荧光显微镜观察，由图3可知，正常未转染细胞无绿色荧光，而重组质粒转染细胞能观测到绿色荧光，荧光多数位于细胞质中，表明重组质粒pCMV-Flag-MTase能成功转染至BHK-21细胞中，其转染效率未受外源插入蛋白的影响。

2.4 DTMUV MTase在BHK-21细胞中的表达

由图4可知，经Western Blot检验，重组DTMUV MTase蛋白与坦布苏病毒阳性小鼠血清能发生特异性结合，条带分子量大小约30 ku，表明重组DTMUV MTase蛋白具有免疫反应活性。

3 讨论

鸭坦布苏病毒作为黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群的重要成员，自2010年4月来，该病迅速传播到我国绝大部分养鸭地区，不仅给养鸭业带来了很大经济损失，而且极大地影响和制约了我国养鸭业乃至畜牧业的稳定健康发展[2]。因此，除了快速研制针对性的疫苗外，深入探索坦布苏病毒致病性、病毒蛋白质的结构功能及快速简便的临床检测方法，也成为现阶段防控坦布苏病毒病发生的重要技术手段。

NS5蛋白是坦布苏病毒基因组编码最大的蛋白质，蛋白质分子量可达100 ku，是黄病毒中最为保守的蛋白。而坦布苏病毒NS5蛋白的N端前900 bp为甲基转移酶活性的主要活性区，同时具有N-7和2′-O这2种甲基转移酶活性且对RNA序列有依赖性，参与病毒基因组RNA复制。有研究发现，当MTase的甲基化位点发生突变时，其病毒复制的能力将显著降低[6]。同时，MTase蛋白对宿主抗病毒反应也有拮抗作用，西尼罗病毒MTase蛋白的 2′-O甲基化功能区可以下调一种干扰素诱导产生蛋白的表达，进而使病毒逃避宿主的天然免疫反应，具体作用机制和生物学反应过程迄今尚不明确[7]。鉴于此，MTase作为DTMUV的主要蛋白酶，与其他非结构蛋白共同作为病毒基因组复制和转录的承载体，负责蛋白翻译后的切割、修饰等重要过程，在DTMUV病毒粒子成熟和复制过程中承担重要角色。又由于MTase在黄病毒属病毒中具有高度保守的氨基酸序列[7]，因此可以作为研究抗坦布苏病毒相关药物和疫苗的关键靶标。目前，关于坦布苏病毒MTase蛋白相关研究较少，本研究通过克隆DTMUV MTase蛋白编码基因，并成功克隆至pCMV-Flag真核表达载体，通过间接免疫荧光和Western Blot试验检测，发现MTase蛋白表达成功。本研究获得的重组坦布苏病毒MTase蛋白可作为包被抗原，建立ELISA方法来检测血清中的抗体水平，亦可以用来筛选具备诊断功能/中和活性的单克隆抗体，此外，还为研究坦布苏病毒的感染致病机制提供了基础。

参考文献：

[1]吴 双，姜 勇，徐建生，等. 鸭坦布苏病毒、鸭肠炎病毒和番鸭细小病毒TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用[J]. 江苏农业学报，2020，36（3）：626-633.

[2]杨志远，段会娟，王小蕾，等. 4株鸭坦布苏病毒的毒力、E基因序列和抗原差异性[J]. 中国农业科学，2019，52（23）：4406-4414.

[3]Egloff M P，Benarroch D，Selisko B，et al. An RNA cap （nucleoside-2′-O-）-methyltransferase in the flavivirus RNA polymerase NS5：crystal structure and functional characterization[J]. The EMBO Journal，2002，21（11）：2757-2768.

[4]Geiss B J，Thompson A A，Andrews A J，et al. Analysis of flavivirus NS5 methyltransferase cap binding[J]. Journal of Molecular Biology，2009，385（5）：1643-1654.

[5]Zhou H，Wang F，Wang H，et al. The conformational changes of Zika virus methyltransferase upon converting SAM to SAH[J]. Oncotarget，2017，8（9）：14830-14834.

[6]周希珍，赵 慧，高 岚，等. 虫媒黄病毒NS5蛋白的生物学功能研究进展[J]. 军事医学，2012，36（1）：70-72.

[7]Dong H，Zhang B，Shi P Y. Flavivirus methyltransferase：a novel antiviral target[J]. Antiviral Research，2008，80（1）：1-10.