牡丹的基因组DNA提取与ISSR引物筛选

李会云 程孟雪 李勇慧 刘忠艳

摘要：为了研究牡丹种质资源的遗传多样性和DNA鉴定，采用ISSR标记的方法来进行试验，即采用改良的CTAB法从成熟干燥的牡丹叶片中提取基因组DNA，其质量检测采用琼脂糖凝胶电泳法和超微量分光光度计法，用优化的ISSR-PCR反应系统，对加拿大哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）公布的220条ISSR引物进行筛选。结果表明，从6个牡丹品种的叶片中提取的DNA浓度范围在30×10-3 ～100×10-3 μg/μL之间，DNA样品纯度 D260 nm/D280 nm 比值在1.7～1.9之间;从220条ISSR引物中筛选出了12条适合牡丹的扩增结果好的引物，选出的引物扩增条带清晰、多态性高、重复性好。说明提取的DNA质量较好，该改良的CTAB法适用于从蛋白质和酚类物质含量较高的植物材料中提取基因组DNA;筛选出的12条ISSR引物为进一步研究牡丹资源的遗传多样性奠定了基础。

关键词：牡丹;DNA提取;ISSR引物筛选;PCR扩增;改良的CTAB法

中图分类号：S685.110.1   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）15-0058-06

收稿日期：2020-12-21

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：192102110035）。

作者简介：李会云（1982—），女，河南安阳人，博士，讲师，从事植物生理及分子生物学的教学与科研工作。E-mail：30226972@qq.com。

牡丹（Paeonia suffruticosa），是芍药科芍药属多年生落叶灌木[1]，是一种传统中国花卉，也是世界著名花卉，姿态万千、色彩丰富，不但在园林和花卉文化中占有重要地位，深受中国人民喜爱，而且在对外传播和交流时受到世界人民喜爱。同时，牡丹也是一种重要的花卉植物和资源植物，其药用、文化和观赏历史已约有2 000余年。中国牡丹主要分布在洛阳、兰州、彭州、菏泽、延安、铜陵等地。据调查，不同产地的牡丹共计约有1 500个品种[2-4]。

近年来，RAPD、SSR、ISSR、AFLP和SRAP 等分子标记已广泛用于牡丹的遗传多样性分析、核心种质构建、种质资源分类鉴定等方面[5]。ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是由Zietkiewicz等开发的分子标记[6]。SSR（ simple sequence repeat） 广泛分布在真核植物基因组中，由1～6个碱基对组成，其两端序列通常是相对保守的单拷贝序列，因此，可以设计特异的寡核苷酸引物进行SSR-PCR，根据串联重复序列的数量，通过扩增串联重复序列揭示了SSR的长度多态性[7]。ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，它根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物，扩增出DNA序列在SSR之间的反向排列，然后对扩增产物进行电泳、染色，根据条带的存在及相对位置来分析不同样品间ISSR标记的多态性[8-9]。ISSR标记方法由于其高效性、重复性好、操作简单等特点，被广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析、杂种后代快速鉴定等领域[10]。目前，ISSR标记已经用于湖南、云南香格里拉、福建、四川[11-14]牡丹的遗传多样性分析，然而，ISSR标记尚未用于分析洛阳牡丹的遗传多样性。本试验采用优化的ISSR-PCR反应体系篩选ISSR引物，选出12条引物，为研究洛阳牡丹的遗传多样性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验植物材料采自洛阳市牡丹研究院，共有6个牡丹品种：鹤顶红、文培紫、海棠争润、银粉金鳞、似荷莲、锦袍江，对这6个牡丹品种从1～6依次进行编号，干燥处理后保存于自封袋备用。本试验于2019年在洛阳师范学院生命科学学院生科楼406和509实验室实施。

1.2 主要仪器设备

YXQ-SG46-280S型手提式压力蒸汽灭菌器（施都凯仪器设备有限公司）;101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）;SCIENTZ-48型高通量组织研磨机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;JA2003A型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）;LX-200迷你型离心机（海门市其林贝尔仪器）;TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）;DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）;ChampChemi 610 Plus型全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）;THZ-82A数显恒温振荡器（常州朗越仪器制造有限公司）;SEDIG型梯度PCR仪;Eppendorf AG型PCR仪;K5500 Plus型超微量分光光度计。

1.3 主要试剂

CTAB、EDTA，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;Tris-HCl（pH值=8.0）、三氯甲烷、异戊醇、乙酸钠、冰乙醇、β-巯基乙醇、GoldView I型核酸染色剂、10×DNA loading buffer，均购自北京索莱宝科技有限公司;2×Taq MasterMix混合液（康为，CW0690M）。

1.4 试验方法

1.4.1 牡丹DNA的提取

根据改良的CTAB磁珠法[15]提取牡丹基因组DNA。取少量干燥叶片于 2 mL 的研磨管中，并放入直径3 mm的钢珠，再将研磨管放进组织研磨机中进行研磨，60 s后取出。加入1 000 μL 2% CTAB溶液和8 μL β-羟基乙醇，放入水浴锅中65 ℃水浴1 h，每10 min倒置1次以混均匀。水浴锅中取出后，加入500 μL CI（三氯甲烷 ∶异戊醇=24 ∶：1），摇床10 min（强度约160 r/min左右）。然后在室温下1 200 r/min离心10 min，取上清液650 μL（视具体情况而定）于 1.5 mL 离心管中（弃去有机相）。再加入500 μL CI于1.5 mL的离心管中，摇床摇10 min。然后在室温下1 200 r/min离心10 min，取上清液500 μL（视情况而定）于1.5 mL离心管中（吸取时小心仔细）。加入1/10体积3 mol/L乙酸钠和2倍体积冰乙醇（体积与吸取的上清液相比）低温静置24 h（-20 ℃）。保留白色球状物，倒去溶液（可先离心）。加入 500 μL 75%乙醇清洗2次，倒去溶液（根据情况离心，尽量第1次不离心，第2次离心。1 200 r/min离心2～3 min）。将离心管倒扣在吸水纸或卫生纸上，约5～10 min，常温下干燥DNA，之后再开盖放在烘干机中，50 ℃烘干 20 min 左右。加入适量无菌水（50～100 μL）溶解DNA。

1.4.2 DNA浓度测定

通过超微量分光光度计测定DNA的浓度，通过测定DNA的D260 nm/D280 nm比确定DNA的纯度和完整程度。最后将适用牡丹DNA保存于4 ℃备用。

1.4.3 PCR扩增反应

牡丹PCR反应体系见表1（DNA模板是从35种牡丹中随机选取的6个牡丹基因组DNA）。PCR扩增程序见表2。

1.4.4 琼脂糖凝胶电泳

在锥形瓶中称取0.3 g的琼脂糖，加入30 mL 1×TAE缓冲液，配制成溶液，加热混匀，向溶液中加入2 μL GoldView I型核酸染色剂，混合，倒入模具中（注意不能有气泡，否则会影响跑胶结果），冷却10 min。等琼脂糖胶凝固后，将梳子垂直拔出。在电泳槽内加入1×TAE缓冲液，将配好的胶放入电泳槽中，准备点样。从冰箱拿出扩增好的产物，第1个孔内加入 1 μL 10×Loading buffer和4 μL Marker，之后每个孔内加入5 μL扩增好的产物。按照顺序依次迅速精准点样，以防止样品扩散，导致跑胶条带不清晰。加样完毕后，设置电压为120～130 V，电流为110 mA，电泳时间30～45 min。电泳结束后，轻轻取出凝胶并放入凝胶成像系统中观察成像结果。

1.4.5 引物筛选及退火温度的确定

本试验根据已优化的ISSR-PCR反应体系，用鹤顶红、文培紫、海棠争润、银粉金鳞、似荷莲、锦袍江6个牡丹DNA样品，对UBC公布的220条ISSR引物（表3）进行初筛和复筛，使用温度梯度模式选择合适的退火温度。温度设定为45、50、55、59 ℃4个温度梯度。

1.4.6 数据处理

各个DNA样品的浓度和D260 nm/D280 nm比值采用K5500 Plus型超微量分光光度计进行测定，各组引物的ISSR-PCR扩增图通过Microsoft PowerPoint 2013和 Adobe Photoshop CS5 软件进行制作。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取质量检测结果

通过改良的CTAB法提取牡丹DNA，用超微量分光光度计测DNA浓度。测得DNA浓度范围在30～100 ng/μL，DNA样品纯度D260 nm/D280 nm比值范围在1.7～1.9之间，提取的DNA质量较好，无蛋白质、酚类的污染。

2.2 ISSR引物筛选结果及退火温度的确定

如果退火温度太低，可能会发生非特异性扩增，并降低重复率;但是，如果温度过高又会使条带减少，导致一些可能反应多态性的条带消失[16]。因此确定合适的退火温度十分必要。本研究将温度设定为45、50、55、59 ℃ 4个温度梯度，选择最佳退火温度。最后选出2个退火温度：50、55 ℃。用优化的PCR反应体系对220条引物进行扩增、筛选。根据PCR产物的凝胶成像，最终从220条引物中共筛选出12条扩增条带清晰、多态性好的ISSR引物，引物筛选结果和退火温度的确定（表4、图1、图2和图3）。

3 讨论与结论

牡丹不仅具有较好的观赏价值，同时还有很高的药用价值。为了筛选出适合牡丹遗传多样性分析的ISSR引物，本试验利用改良的CTAB法从牡丹成熟干燥的叶片中提取DNA，與Rawat等的ISSR-PCR反应体系优化研究中同样是选用成熟干叶的试验材料[17]相一致。

利用ISSR分子标记技术研究牡丹遗传多样性和品种鉴定，可以获得 DNA水平上的遗传信息，不受外界环境的影响[18]。ISSR分子标记受多种内在因素的影响，测定的可靠性、稳定性与PCR反应条件密切相关[19-21]。退火温度决定着 PCR 的特异性，它是引物和模板组合时的一个温度参数，过高或过低都会影响 ISSR-PCR 扩增的清晰度及条带的多少[22]。因此，在本试验中采用温度梯度PCR模式，将温度设定为45、50、55、59 ℃4个温度梯度，寻找合适的退火温度。

为了能够获得所需的扩增产物，在该试验中优化了ISSR-PCR反应体系。PCR反应体系中5种成分（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物与模板DNA） 的浓度与反应结果有很大的关系。 TaqDNA

聚合酶是Mg2+依赖性酶，其活性会受到Mg2+浓度变化的影响，对Mg2+浓度比较敏感。Taq DNA 聚合酶用量过多时，不仅会造成成本的浪费，而且会出现非特异性扩增的条带，产生弥散现象，用量过低时会降低扩增效率[23]。本试验刚开始采用10 μL的体系，包括引物0.4 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 08 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，双蒸水5.6 μL，模板DNA 2 μL。凝胶成像显示其扩增结果并不理想。之后用2×Taq MasterMix混合液来代替10×Buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶，换为15 μL反应体系：2×Taq MasterMix 7.50 μL，引物0.75 μL，模板DNA  1.25 μL，双蒸水5.50 μL。凝胶成像显示其扩增条带清晰、多态性高、重复性好。利用此体系对所有引物进行引物筛选， 最终获得ISSR-11、ISSR-44、

ISSR-45、ISSR-48、ISSR-59、ISSR-60、ISSR-81、ISSR-91、ISSR-93、ISSR-94、ISSR-97、ISSR-125共12条ISSR引物。本试验用2×Taq MasterMix混合液来代替10×Buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶，不仅可以有效解决它们之间的浓度配比问题，还可以节省操作时间、避免污染，与李振山在枣研究中使用的ISSR-PCR反应体系和试验结果[24]相似。

本研究结果表明，从鹤顶红、文培紫、海棠争润、银粉金鳞、似荷莲和锦袍江6个牡丹品种的叶片中提取的基因组DNA浓度范围在30～100 ng/μL之间，DNA样品纯度D260 nm/D280 nm比值在1.7～1.9之间，表明所提取的6个样品的DNA质量较好，没有蛋白质和酚类物质的污染，证实了该改良的CTAB法适用于从蛋白质和酚类物质含量较高的植物材料中提取基因组DNA。从220条ISSR引物中筛选出了12条引物，以6个牡丹品种的基因组DNA为模板，通过优化的ISSR-PCR反应体系进行扩增，凝胶成像结果显示，扩增条带清晰、多态性高、重复性好，共筛选出了12条引物，为研究牡丹遗传多样性分析奠定了基础。

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