W/O/W型党参多糖纳米乳免疫增强剂制备及性质研究

时菲菲, 曹金花, 于生兰, 杨海峰

(江苏农牧科技职业学院动物药学院，江苏 泰州 225300)

党参[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]，桔梗科(Campanulaceae)党参属(Codonopsis)，一种被广泛使用的药食两用植物，在动物临床中常用于体倦无力、少食气虚等症状的治疗。党参含有多糖、生物碱、甾醇、皂苷等多种有效成分，多糖是党参中含量最高的天然生物活性物质[1-2]，具有调节免疫系统[3]、调节血液循环系统[4]、抗衰老[5]等作用。近年来，党参多糖作为免疫增强剂的应用研究成为热点，对免疫器官、免疫细胞和免疫分子[6]都有较好的调节作用，给药方式以直接口服或制备成普通口服液为主，存在给药后易被胃酸及胃肠道内的酶降解，降低给药后生物利用度的问题，限制了药效的发挥。

纳米乳是粒径在1～200 nm范围内的乳剂型药物载体，具有稳定性好、缓释、生物利用度高等优点，主要有O/W型、W/O型、W/O/W型和O/W/O型[7-8]，在药物制剂应用中可根据生物活性物质本身的物理化学特性和给药特点选择适合的类型。目前，对纳米乳制剂的研究主要集中在W/O型和O/W型，而对W/O/W型和O/W/O型研究较少。W/O/W型和O/W/O型纳米乳又称复合型纳米乳，在结构上具有独特的“两膜三相”多室结构[9]，不同的相可以溶解不同性质的物质，同时起到隔离保护、缓控释、掩味的作用，因此，复合型纳米乳是优良的药物载体。目前，复合型纳米乳在兽药方面已应用到维生素[10]、抗菌药物[11]、非水溶性驱虫药[12]等多种药物，而作为免疫增强剂载药系统的应用鲜见报道，未见W/O/W型党参多糖纳米乳免疫增强剂的相关报道。本研究利用党参多糖构建W/O/W型党参多糖纳米乳免疫增强剂载药体系，以期有效增强党参多糖的免疫调节作用，为党参的合理利用和党参多糖免疫增强剂新剂型开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

党参药材购于珠海药材公司；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)购自上海麦克林生化科技有限公司；吐温-80、HEL-40、Span-80、丙三醇、PEG-400均购自成都艾科达化学试剂有限公司。

试验仪器包括：涡旋机(VORTEX-5 ，海门市其林贝尔仪器有限公司)、探头超声仪(03040518系列，江苏伟禾生物科技有限公司)、激光粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS，英国Malvern instrument公司)、透射电子显微镜(HT7700，日本Hitachi公司)。

1.2 试验方法

1.2.1党参多糖的提取、纯化和含量测定 党参根切片，于40 ℃烘箱中烘干。称取干燥的党参片150 g，于300 mL蒸馏水中浸泡12 h，在90 ℃条件下浸提党参多糖2.5 h，浸提结束后过滤，滤液于3 000 r·min-1离心10 min。取上清液并加入3倍体积的95%乙醇，混匀并静置12 h后3 000 r·min-1离心15 min，收集沉淀并用蒸馏水复溶，用sevage试剂沉淀蛋白质，上清液离心后浓缩并冷冻干燥得到党参多糖。参照叶英等[13]的方法测定党参多糖含量。

1.2.2W/O型初乳处方筛选 以IPM为油相，吐温-80和HEL-40分别为乳化剂和助乳化剂，分别以体积比9∶1、8∶2、7∶3和6∶4混合乳化剂和助乳化剂形成混合物(Smix)，Smix再分别与油相以体积比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6;4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10混合均匀后，在25 ℃水浴中，探头超声作用下缓慢滴加蒸馏水，至形成透明、均一的W/O初乳，并利用各组分用量以水相、油相和Smix为顶点构建伪三元相图，分析确定合适的油相、乳化剂、助乳化剂和水相用量，从而确定处方组成。

1.2.3W/O/W型纳米乳处方筛选 以W/O型党参多糖纳米乳作为油相，蒸馏水作为水相，分别选取HEL-40、Span-80为乳化剂，丙三醇、PEG-400为助乳化剂，按照表1将乳化剂和助乳化剂以不同比例混合(Kv)，再加入处方比例的水相和油相，涡旋2 min，制备W/O/W型党参多糖纳米乳。

表1 W/O/W型党参多糖纳米乳处方筛选Table 1 Formulation screening of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemulsion

1.3 性质考察

1.3.1外观 观察制备的W/O型初乳和W/O/W型党参多糖纳米乳，外观应呈现澄清均一、透明或半透明状态并伴有淡蓝色乳光，平行光通过溶液时应出现丁达尔现象。

1.3.2类型鉴别 利用染色法分别鉴别W/O型初乳和W/O/W型党参多糖纳米乳类型。红色油溶性染料苏丹红Ⅲ和蓝色水溶性染料亚甲基蓝加入到两种乳剂中。连续相为油相时红色扩散速度

快，可判定为W/O或O/W/O型；连续相为水相时蓝色扩散速度快，可判定为O/W或W/O/W型。

1.3.3粒径分布 利用Zetasizer Nano SZ®测定W/O/W型党参多糖纳米乳粒度分布和多分散指数(polydisperse index，PDI)。将纳米乳用蒸馏水以1∶100比例稀释，设定散射角为173°，在25 ℃条件下检测。

1.3.4Zeta电位 利用Zetasizer Nano SZ®测定W/O/W型党参多糖纳米乳样品电泳迁移率获得Zeta电位值。将纳米乳用1 mmol·L-1NaCl溶液以1∶250比例稀释，在25 ℃条件下检测。

1.3.5pH 在25 ℃条件下，利用pH计测定W/O/W型党参多糖纳米乳样品pH。

1.3.6微观形态 用蒸馏水将W/O/W型党参多糖纳米乳溶液1∶100稀释，取适量滴在覆有支持膜的铜网上，室温下静置20 min，用滤纸吸干。再滴加适量2%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，室温下自然挥干，利用透射电镜观察纳米乳微观形态。

1.3.7稳定性考察 取适量党参多糖纳米乳样品装于透明玻璃螺口瓶内，分别静置于：①50 ℃条件下;②相对湿度75%、温度25 ℃条件下;③4 000 lx光照条件下;在上述3种条件下分别进行高温、高湿和光照试验。各样品分别在0、5、10 d取样，检查稳定性。

2 结果与分析

2.1 党参多糖含量测定结果

对提取的党参多糖纯化，经测定党参多糖含量为15.66%±0.04%。

2.2 W/O党参多糖初乳处方的组成

从图1可以看出，当乳化剂和助乳化剂体积比为9∶1、8∶2、7∶3和6∶4时，伪三元相图中形成W/O型初乳区域面积先增大后变小。当体积比为7∶3时面积最大，体积比为6∶4时面积最小，可见乳化剂与助乳化剂最佳体积比为7∶3。当乳化剂与助乳化剂体积比为7∶3时，Smix与油相体积比为8∶2～3∶7时，均可形成纳米乳，考虑纳米乳稳定性及乳化剂和助乳化剂用量尽量低的原则，确定Smix与油相体积比为5∶4。

图1 W/O型初乳处方筛选伪三元相图Fig.1 Screening pseudo-ternary phase diagram of W/O colostrum prescription

2.3 W/O/W型党参多糖纳米乳处方的组成

不同处方条件下制备W/O/W型党参多糖纳米乳，粒径和外观考察结果如表2所示。由表2中数据可知，当表面活性剂与助表面活性剂分别为HEL-40和丙三醇，比例为1∶1和2∶1时，结果较好，肉眼观察外观均一，呈现半透明状态，略显乳白色，粒径分别为(122.32±2.27) nm(PDI: 0.099±0.032)和(153.76±1.32)nm(PDI: 0.117±0.060)，静置24 h内稳定。HEL-40和丙三醇比例为1∶2时，制备结束初始状态外观呈现半透明状态，略显乳白色，静置24 h后，外观呈现乳白色，未出现破乳分层现象，这可能与稳定性相关，静置后乳滴微粒聚集，导致粒径变大，出现了外观从略显乳白色到乳白色的变化。当乳化剂为Span-80时，粒径在(1 020.22±4.39)～(1 392.08±2.76)nm范围内，静置30 min后均出现分层；当乳化剂为HEL-40，助乳化剂为PEG-400时，粒径大小为625.33～692.82 nm范围内，静置6 h后均出现分层现象。可见，处方A′和A″为最佳W/O/W型党参多糖纳米乳处方的组成。

表2 不同处方下W/O/W型党参多糖纳米乳的粒径和外观Table 2 Particle size and appearance of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under different prescription conditions

2.4 W/O/W型党参多糖纳米乳的性质

2.4.1外观和类型 制备的初乳外观透明，党参多糖纳米乳外观半透明，均呈现澄清均一状态，伴有淡蓝色乳光，平行光通过溶液时出现丁达尔现象。经染色法鉴别，初乳的红色扩散速度快于蓝色，为W/O型；党参多糖纳米乳的红色扩散速度慢于蓝色，为W/O/W型。

2.4.2Zeta电位和pH 表3显示了处方A′和A″的Zeta电位和pH测定结果，2个处方的Zeta电位均接近于电中性，pH分别为6.3和5.5。

表3 处方A′和 A″下W/O/W型党参多糖纳米乳的Zeta电位和pHTable 3 Zeta potential and pH of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.3微观形态 透射电镜观察处方A′和A″的微观形态如图2所示。从图2可以看出，2个处方制备的W/O/W型党参多糖纳米乳微粒大小均匀，无黏连，粒径在100～200 nm范围内。

图2 处方A′和 A″下W/O/W型党参多糖纳米乳透射电镜Fig.2 Transmission electron microscopy micrographs of W/O/W Codonopsis pilosula polysaccharide nanoemlsions under formulation A′and A″

2.4.4稳定性试验结果 处方A′和A″制备的W/O/W型党参多糖纳米乳稳定性考察试验结果见表4。2个处方的样品在高温、高湿及光照条件下稳定性良好，外观均一，略带乳白色，无絮凝、破乳等现象，粒径在高温条件下略有增加，在高湿和光照条件下无明显变化，提示样品保存应注意避免高温。

表4 稳定性考察Table 4 Stability investigation

3 讨论

由于纳米乳载药系统具有多种给药途径[14-15]，近年来该剂型得到越来越广泛的研究，但多数研究集中于O/W型和W/O型，而对W/O/W型复乳的研究较少。W/O/W型纳米乳也被称为双乳液，即乳液中的乳液，是由分散在油相中的水相形成一级W/O初乳，初乳进一步分散在水相中形成W/O/W复乳。利用该给药系统可以通过口服给药方式吸收胃肠道环境不稳定的亲水性化合物[16]，另外由于其特殊的“两膜三相”结构，该系统可以同时承载亲水性化合物和亲油性化合物[17]，该剂型的研究对拓宽药物应用途径具有重要意义。

由于多糖具有水溶性好的特点，近年来多糖纳米乳制剂的研究多以W/O型为主。李树鹏[18]制备了W/O型黄芪多糖纳米乳免疫佐剂，可有效促进鸡脾脏淋巴细胞NO的产生，刺激T细胞不同亚群调节Th细胞分泌细胞因子，发挥免疫调节作用，效果优于黄芪多糖；马红梅[19]制备了W/O型蒲公英多糖纳米乳，能使小鼠免疫器官指数升高，促进免疫器官生长发育，刺激机体体液免疫、细胞免疫和非特异免疫，增强小鼠免疫力。作为液体兽用制剂，常以饮水方式给药，W/O型纳米乳外相为油相，无法与饮用水混溶，故在给药时存在一定的局限性。本研究筛选出合适的油相、乳化剂和助乳化剂，成功制备了W/O/W型党参多糖纳米乳制剂，有效解决了上述问题，可与水以任意比例混溶，给药方便，剂量精确。

W/O/W型纳米乳的制备通常采用两步法，第一步制备W/O型初乳，第二步制备W/O/W型复乳[20]，而在制备过程中通常需要输入较高的能量，这极大地限制了该剂型在热敏感药物中的应用[21]。针对这一问题，近年出现了一步自乳化法制备W/O/W型纳米乳[22]，该方法在低能条件下制备完成，但需要使用大量的乳化剂，易产生细胞毒性效应，且形成的乳剂粒径较大，从而限制了给药途径。本研究通过绘制伪三元相图筛选处方组成，利用超声法制备W/O初乳，通过涡旋的方法完成W/O/W型复乳的制备，不易破坏药物化学结构，同时优选出的2个处方乳化剂用量较低，为11%和12.5%，同时平均粒径较小，为(122.32±2.27)和(153.76±1.32)nm，具有较高的稳定性和安全性。

本研究利用伪三元相图进行初乳处方筛选，采用两步法制备了W/O/W型党参多糖纳米乳免疫增强剂。研究结果表明，微粒大小均匀，无黏连，粒径在100～200 nm范围内，稳定性好，为党参多糖作为免疫增强剂应用提供了一种更优的制剂选择。本课题组将在此研究基础上进一步考察党参多糖免疫增强剂在动物体内的免疫增强效果，并与党参多糖溶液剂进行对比，同时对比研究其在动物体内的缓释效果，以更好地为在现代畜牧养殖中推广应用奠定理论基础，对推进畜牧养殖业发展具有重要意义。