苯酚生物降解菌的筛选及降解特性研究

摘要：苯酚是一种存在于环境中对人体和动物有害的有机物，并且自然条件下难以降解。本文旨在通过对苯酚降解微生物的探究来寻求一种绿色环保的苯酚生物处理办法。首先通过苯酚梯度平板来筛选出高浓度苯酚耐受菌株，将其接入斜面保藏;再使用以苯酚为单碳源的液体LB培养基进行筛选，得到能够利用苯酚的菌株;之后再使用不同浓度苯酚的平板进行接种培养，进一步得到更加高耐受苯酚菌株，期间我们还可以进行单菌落形态观察和革兰氏染色等方法对菌株进行研究;最后通过单因素随机试验的方法来探究不同浓度苯酚对同一菌株生长的影响。

关键词：苯酚;微生物;紫外分光光度计;F检验

1 引言

苯酚，也叫石炭酸，分子式C6H5OH，是具有特殊气味的无色针状晶体，有毒，常存在于皮革制造、合成纤维、炼油、染料、医药及杀菌剂、造纸等工业生产中，是煤气厂、纤维厂、炼油厂及焦化厂等工业排放废水中含量较多的物质，如果处理不当苯酚容易吸附于底泥上。本次采样点为河南理工大学南校区第二图书馆后方的污水河流中，采样为潮湿岸土和黑色污泥的混合土。由于该河流途径污水处理厂，因此推测苯酚降解菌较多。

当今涌现出了许多处理苯酚的方法，最主要的为电化学法，生物降解法和物理的吸附法，而其中最佳的方法还数生物降解法，生物降解法所具有的成本低、二次污染少以及经济高效等优点。因此本文主要对苯酚生物降解菌的筛选及降解特性研究进行综述，为大家提供一个新的研究思路。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株来源

从河南理工大学第二图书馆后方污水沟中采集的黑色污泥和潮湿岸土混合物，现取现用。

2.1.2 实验器材及试剂

高压灭菌锅;恒温培养箱;恒温摇床;超净工作台;紫外分光光度计;电炉;电子天平;水浴锅;冰箱;三角瓶;玻璃棒;培养皿;试管;刻度滴管;玻璃珠;涂布棒;接种环等。

苯酚;1mol/L 氢氧化钠;1mol/L HCL

2.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，（琼脂20g/L），PH7.4 ～ 7.6，苯酚视情况而加。

以苯酚为单碳源的液体LB培养基：胰蛋白胨10.0g，NaCl10.0g/L，苯酚800mg/L，PH：7.2 ～ 7.4

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，PH：7.2 ～ 7.4

2.2 实验方法

2.2.1 苯酚耐受性菌株的初选：

取10g混合土壤倒入装有玻璃珠的含90ml无菌水的三角瓶中制成10-1土壤悬液，继续稀释做成不同稀释度。每个浓度做平行对照，分别涂布到含有300mg/L牛肉膏蛋白胨梯度平板中，并置于30℃恒温培养箱中培养1～2天。长出菌落后，挑取高浓度生长的单菌落5个并接种于斜面培养基上，进行编号后4℃冰箱保存备用。

2.2.2 以苯酚为单碳源的菌株的筛选

先将斜面保存的菌落进行新斜面的转接，刮取剩余菌体并用无菌水稀释后，倒入以苯酚为单碳源的液体LB培养基中，分别编号。在刚接种后使用空白对照先测量其初始OD600，150r/min条件下培养1～2天，期间可多次测量其OD600，观测其吸光度变化从而评估其生长状况。

2.2.3 高耐受性苯酚降解菌的筛选及观察

获得生长状况较好的菌株之后，再用800mg/L、1200mg/L，1600mg/L三个浓度对其进行筛选，每个浓度做平行对照，可获得耐受能力好、降解程度高的苯酚降解菌。涂布接种并培养1～2天后，可观察到平板上长出的单菌落，可对其个体形态、群体特征、生理生化等特点进行观察。还可挑取菌落进行革兰氏染色实验来判断所选菌落是革兰氏阳性菌还是阴性菌。

2.2.4 苯酚降解菌降解特性研究

取生长较好的菌株以浓度作为单因素进行完全随机试验，以1000mg/L、1400mg/L、1800mg/L为三个浓度变量，每个浓度设置平行对照，每个三角瓶都加入100ml含有苯酚的LB液体培养基，在9个三角瓶中加入等量（1ml）菌悬液后先测量其初始OD600，然后在恒温摇床中于30℃，150rpm条件下培养24h并进行OD600的测定，对比前后OD600的差值并进行F检验的数据分析计算。

3 结果与分析

3.1 苯酚耐受性菌株的初选

经过初步的筛选获得五株高浓度耐受苯酚菌株，将其分别编号为①②③④⑤，接种斜面后长势良好。

3.2 以苯酚为单碳源的菌株的筛选

培养后各瓶液体均变得较为浑浊其中①②③⑤在培养0～27h内均呈现出先上升后下降的趋势，仅有④号菌株一直缓慢上升。

3.3 高耐受性苯酚降解菌的筛选及观察

①④号菌株长出单菌落较密，可能由于菌悬液浓度较高或涂布量较多。①号菌落形态观察结果：小菌落，密集，潮湿，表面略微凸起，边缘锯齿状，乳白色;④号菌落形态观察结果：大菌落，稀疏，潮湿，表面略微凸起，边缘锯齿状，周围有透明带，白色。通过革兰氏染色观察到这两种菌株均为革兰氏阳性菌。

3.4 苯酚降解菌降解特性研究

通過F检验可得其F*=7.804，

由于F0.05（2，6）

因此各处理之间差异显著，表明不同浓度苯酚对同一菌株生长有影响。

4.小结

本文旨在提出一种苯酚生物降解菌的筛选及降解特性研究的方法和思路，读者可根据自身具体情况进行相关实验的变动与创新，通过多种方法进行完善总结才是做好探究性实验的基础性工作。

参考文献：

[1]姜立春，纪思萌，王婷，何会，阮期平.苯酚降解菌株JY04的筛选、分离与鉴定[J].绵阳师范学院学报，2017，36（02）：43-47.

[2]曹晶晶，李玉洁，常玉广.焦化废水中苯酚去除效率的研究[J].南京晓庄学院学报，2020，36（06）：55-58.

[3]王莹，陈虎，王衍旺，吕永康.生物法处理酚类废水的研究进展[J].现代化工，2017，37（03）：58-62.

作者简介：李帅（1999-12-），男，回族，河南周口人，本科在读，河南理工大学学生 生物技术专业。

河南理工大学资源环境学院  河南  焦作  454003