Hedgehog信号通路与“肾虚血瘀”骨代谢失常的实验研究

邓洋洋 刘明欣 孙鑫 王庆谚 蒋宁 高巳东 王重一 林浩楠 郑洪新

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是最常见的骨骼疾病，是一种以骨量低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。绝经后骨质疏松症(postmenopausal-osteoporosis，PMOP)在骨质疏松症中占有比例最大，其骨折而带来的致死、致残率极高，是亟待解决的重要问题。Hedgehog信号通路对骨代谢具有重要的调节作用，近年来其在骨生物学中的作用受到更多的关注。本研究以Hedgehog信号通路PTCH1和Gli3为切入点，旨在观察补肾填精中药复方左归丸、活血化瘀中药复方身痛逐瘀汤对PMOP模型大鼠的疗效影响，为临床防治PMOP以及骨重建失常引起的其他慢性疾病提供最佳的中医药治疗方案，并为其作用机制提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级SD大鼠，雌性，3～4月龄，50只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001[2-3]。

1.1.2实验药品：补肾填精中药复方：左归丸(购于辽宁中医药大学附属第一医院)；活血化瘀中药复方：身痛逐瘀汤(购于辽宁中医药大学附属第一医院)；阳性对照药：骨疏康颗粒。

1.1.3主要试剂和仪器：ELISA试剂盒(美国R&D systems公司)、PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Erase(Takara公司)、Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies公司)等。双能 X 线骨密度分析仪(美国 Lunar公司)、Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪(德国安捷伦)、PROTEANTMⅡ聚丙烯凝胶电泳(美国LTI)、凝胶成像分析系统(上海天能)、XE380超低温冰箱(法国)、3111二氧化碳培养箱(美国)、IX71FL倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS)、KOHTRON高速低温离心机(瑞典)、DU640核酸蛋白分析仪(美国)、Bio-Rad550型酶标仪(美国)、PCS-SP2激光共聚焦显微镜(德国Leica)、ALP30R50液氮生物容器(中国精骐)等。

1.2 方法

1.2.1实验动物模型建立和分组：采用一次性手术摘除大鼠双侧卵巢造模方法[注：去卵巢大鼠是世界卫生组织(WHO)推荐的研究绝经后骨质疏松症模型]。术后3 d，进行实验分组。按体重分层后按照随机数字表随机分为补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组、模型空白组及正常组。

1.2.2实验给药剂量和方法：给药剂量：大鼠等效剂量按成人每日用药量的6.3倍计算，给药容积为1 ml/100 g体重。给药方法：补肾填精组给予左归丸，活血化瘀组给予身痛逐瘀汤，阳性对照组给予骨疏康颗粒，模型空白组和正常组给予等体积的生理盐水。每日灌胃1次。每周称重1次，根据体重变化重新计算给药剂量，共灌胃12周。最后一次灌胃禁食24 h后取材。

1.2.3标本采集与检测

1.2.3.1骨密度：取各组大鼠左侧股骨，剔除肌肉，生理盐水冲洗，纱布包好后封存，应用双能X线骨密度分析仪检测[2-3]。

1.2.3.2骨组织和肾组织PTCH1和Gli3蛋白含量测定：取出右侧股骨和左肾后，一部分用锡纸包好，具体检测步骤按ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.3.3骨组织和肾组织PTCH1和Gli3mRNA表达测定：取出右侧股骨和左肾后，一部分放入有Trizol液的EP管，使用Primer-BLAST设计引物，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计分析

2 结果

2.1 骨密度结果

各组间比较，模型空白组比正常组骨密度降低，具有显著性差异(P<0.01)，说明造模成功。补肾填精组、阳性药物对照组比模型空白组的骨密度提高，具有显著性差异(P<0.01)，活血化瘀组比模型空白组的骨密度提高，具有统计学意义(P<0.05)。提示补肾填精、活血化瘀中药复方可以提高大鼠去势后骨密度，纠正骨代谢失常，其中补肾填精中药复方优于活血化瘀中药复方[2-3]。见表2。

表2 各组大鼠股骨骨密度检测结果比较

2.2 各组大鼠骨组织中PTCH1mRNA及其蛋白表达

各组大鼠骨组织中PTCH1mRNA相对表达量方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调PTCH1 mRNA相对表达量优于活血化瘀组和阳性药物对照组。各组大鼠骨组织中PTCH1蛋白方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调PTCH1 蛋白含量优于活血化瘀组。见表3。

表3 大鼠股骨中PTCH1mRNA相对表达量和PTCH1蛋白含量结果

2.3 各组大鼠肾组织中PTCH1mRNA及其蛋白表达

各组大鼠肾组织中PTCH1mRNA方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调PTCH1 mRNA相对表达量优于活血化瘀组。各组大鼠肾组织中PTCH1蛋白方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，补肾填精组比阳性对照组显著降低(P<0.01)，补肾填精组比阳性对照组显著升高(P<0.01)，提示补肾填精组下调蛋白含量优于活血化瘀组和阳性药物对照组，但没有阳性药物对照组下调得好。见表4。

表4 大鼠肾组织PTCH1mRNA相对表达量和PTCH1蛋白含量结果

2.4 各组大鼠骨组织中Gli3mRNA及其蛋白表达

各组大鼠骨组织中Gli3mRNA方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组大鼠比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组降低(P<0.05)、补肾填精组比阳性对照组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调Gli3mRNA相对表达量优于活血化瘀组和阳性药物对照组。各组大鼠骨组织中Gli3蛋白方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组降低(P<0.05)，提示补肾填精组下调Gli3蛋白含量优于活血化瘀组；补肾填精组比阳性对照组显著上升(P<0.01)，提示阳性对照组下调Gli3蛋白含量优于补肾填精组。见表5。

表5 大鼠股骨中Gli3mRNA相对表达量和Gli3蛋白含量结果

2.5 各组大鼠肾组织中Gli3mRNA及其蛋白表达

各组大鼠肾组织中Gli3mRNA方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调Gli3mRNA相对表达量优于活血化瘀组。各组大鼠肾组织中Gli3蛋白方面，各个组间比较，模型空白组比正常组显著升高(P<0.01)；补肾填精组比模型空白组显著降低、活血化瘀组比模型空白组显著降低、阳性对照组比模型空白组显著降低，均具有显著性差异(P<0.01)；补肾填精组比活血化瘀组显著降低(P<0.01)，提示补肾填精组下调Gli3蛋白含量优于活血化瘀组；阳性对照组比补肾填精组显著下降(P<0.01)，提示阳性对照组下调Gli3蛋白含量优于补肾填精组。见表6。

表6 大鼠肾组织中Gli3mRNA相对表达量和Gli3蛋白含量结果

3 讨论

3.1 PMOP的中医病因病机

中医“肾藏精主骨”理论是藏象学说的重要组成部分，从“肾主骨”理论防治骨代谢失常的疾病特别是骨质疏松症,在临床上具有特色和优势。“肾主骨”理论最早见于《黄帝内经》诸多篇章，如《素问·宣明五气》曰：“肾主骨”。在《素问·上古天真论》这一篇，将女子以七为序，男子以八为序，分别论述了肾中精气从稚嫩到充盛继而衰减，人的外在形体的齿、发、骨有着相应的变化。可见，人体的骨骼得到充足的肾精滋养才能正常的发育生长，维持坚实的状态。当肾藏精失职，肾精气亏虚，骨失所养，便形成骨质疏松症。

由于绝经后女性往往脏腑生理功能衰退，影响精、气、血、津液的生成和运行，常常发生气虚无力行血，导致血液运行迟缓，久而久之形成瘀血，使血脉、经络不通，不通则痛，骨骼产生疼痛的症状。孙益等[4]通过临床流行病学调查发现，瘀血质占绝经后骨质疏松症的11%，且临床症状上患者出现腰背部明显的刺痛、固定不移、动则加重、舌暗有瘀斑、脉细涩等表现。所以针对上述PMOP的中医病因病机，本次研究采用补肾填精、活血化瘀法进行干预治疗，并且比较两种不同治疗方法的疗效。临床上中药骨疏康颗粒具有补肾益气，活血壮骨的功效，主治肾虚、气血不足所致的中老年骨质疏松症，伴有腰脊酸痛、足膝酸软、神疲乏力等症状。临床应用十余年，疗效肯定，所以本次研究选取中药骨疏康颗粒作为阳性药物对照组。

研究结果提示，补肾填精、活血化瘀中药复方、阳性药物对照组均可以提升大鼠股骨骨密度，其中补肾填精组和阳性药物对照组在提高骨密度方面，与模型组比较具有显著性差异。活血化瘀组在提高骨密度方面与模型组比较差异，具有统计学意义。从骨密度数值来看，补肾填精组高于活血化瘀组，但补肾填精、活血化瘀组之间比较差异并无统计学意义。说明两种中药复方都能够促进骨骼修复，对PMOP的骨代谢失衡起到调节作用，从而起到防治作用。

3.2 Hedgehog信号与骨质疏松症的关系

3.2.1Hedgehog信号与骨代谢：Hedgehog( hedgehog，HH) 信号通路对骨代谢具有重要的调节作用，近年来其在骨生物学中的作用受到更多的关注。HH信号通路对骨形成及MSCs 成骨分化进行调控[5]。Hedgehog蛋白家族主要包括3种同源蛋白质，分别是Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)。本研究团队在前期工作的基础上围绕Hedgehog信号通路开展了探讨PMOP骨代谢失常的分子机制研究。研究发现，去卵巢骨质疏松症模型大鼠Hedgehog信号通路中蛋白家族SHH、Gli1异常表达，可能是导致骨质疏松症发病的机制之一[2-3]。

3.2.2PTCH1、Gli3与骨代谢：Hedgehog信号通路发生作用的过程中，Hedgehog信号分子可与细胞表面受体PTCH1结合，使靶基因平滑受体Smo活化，活化的Smo与类运动蛋白Cos2等结合形成复合物，该复合物可激活Hedgehog信号通路中锌指蛋白家族Glis，促使Glis进入核内聚集并激活转录，进而启动下游靶基因的表达[5]。PTCH1是Hedgehog信号通路中一个关键的结合点[6]。PTCH1究竟在PMOP发病机制中扮演何种角色，是否因为PTCH1的异常改变导致Hedgehog信号通路被激活而引起骨代谢异常，将是本次实验继续关注的内容，即试探讨PMOP的发病机制与PTCH1和Gli3的关系。

4 小结

本研究结果表明，正常组大鼠骨、肾组织中可以表达PTCH1和Gli3mRNA及其蛋白。与正常组比较，模型组大鼠骨组织和肾组织中PTCH1和Gli3mRNA表达及其蛋白含量显著升高；与模型空白组比较，各个用药组均能使PTCH1和Gli3mRNA表达及其蛋白含量显著下调；各个用药组间比较，补肾填精组PTCH1和Gli3mRNA表达及其蛋白含量下调优于活血化瘀组，有显著性差异。研究结果提示，PTCH1mRNA及蛋白含量和Gli3mRNA及蛋白含量在去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织和肾组织中显著升高，提示PTCH1和Gli3可能参与绝经后骨质疏松症骨代谢失衡的发生和进展。补肾填精中药复方和活血化瘀中药复方可下调PTCH1和Gli3mRNA相对表达量及其蛋白含量，这可能是起到防治绝经后骨质疏松症的作用机制之一。