芪骨胶囊治疗绝经后骨质疏松症的分子机制

张洁帆 许坤 陈元川 郭海玲 庞坚* 赵咏芳

1.上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 200120

2.上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 200120

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是由于女性绝经后雌激素水平下降造成骨密度和骨量下降，导致骨强度受损、骨折风险增加的全身代谢性骨病[1]。调查[2]显示，我国50岁以上女性人群骨质疏松症患病率为20.7%，随着社会老龄化进程的不断加剧，未来患病率可能会继续升高。目前指南推荐的一线药物并不十分符合临床预期，尤其是药物的不良副反应受到关注，例如：双膦酸盐类药物相关的胃肠道反应、肾脏毒性、下颌骨坏死、非典型股骨骨折等，雌激素类药物可增加子宫内膜癌、乳腺癌、血栓发生等风险[3]。因此，新疗法、新制剂的研发仍是骨质疏松症研究领域的重要课题。

芪骨胶囊为上市中药制剂，原名密骨胶囊、补肾方，来源于石印玉教授治疗骨质疏松症的经验方[4-5]，《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识》推荐用于PMOP治疗[6]。临床研究[4,7-9]显示其可维持PMOP患者骨密度，并改善腰背痛、腰膝酸软无力、头目眩晕等肝肾不足的临床症状，基础研究[10-14]显示其能抑制破骨细胞破骨功能并促进成骨细胞增殖与矿化能力，但在分子水平的研究仍有待深入。在本研究中,课题组尝试通过网络药理学方法，探讨芪骨胶囊治疗PMOP的活性成分及具体分子机制，以期为后续的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 筛选芪骨胶囊活性成分及相关靶点

本研究运用BATMAN-TCM数据库[15]，分别以“HESHOUWU”“SHIHU”“YINYANGHUO”“ROU CONGRONG”“HUANGQI”“GUSUIBU”“JUHUA”为关键词进行检索，再以Score_cut off≥35且AdjustedP-value<0.05为条件进行筛选，获得芪骨胶囊的药物活性成分及其相对应的潜在靶点。

1.2 获取PMOP的疾病靶点

1.2.1GEO芯片分析PMOP的疾病靶点：在GEO数据库中下载编号为GSE7158的基因芯片原始文件及平台数据，该基因芯片是对26例峰值骨量(PBM)高低不同的中国女性的循环单核细胞进行全基因组基因差异表达研究，其中低PBM12例，高PBM14例。本研究运用R软件(v4.0.0)，以P<0.05且|lgFC|>1为条件，对该基因芯片进行二次分析，筛选出差异基因，并绘制热图和火山图。

1.2.2检索已知的PMOP疾病靶点：本研究运用GeneCards数据库，以“postmenopausal osteoporosis”为关键词，搜索与PMOP相关的疾病靶点，并将数据导出，筛选出相关性得分(Relevance score)最高的前300个靶点。

1.3 获取“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点

运用R软件将1.1中筛选获得的芪骨胶囊药物活性成分对应的潜在靶点与1.2中获得的PMOP靶点取交集获得“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点。

1.4 绘制“药物-活性成分-靶点”网络图

将1.1中获得的芪骨胶囊的药物活性成分及其相对应的潜在靶点与1.3中所获得的“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点数据进行处理之后导入Cytoscape软件(v3.7.0)中，绘制出“药物-活性成分-靶点”网络图。

1.5 构建“芪骨胶囊-PMOP”蛋白互作(PPI)网络

将1.3中获得的“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点导入String在线软件(https://string-db.org/，v11.0)，选择物种为“Homo sapiens”，设置最小互作得分为0.7，构建出PPI网络图，并导出数据。

1.6 筛选“芪骨胶囊-PMOP”核心靶点

对1.5中导出的数据进行处理，将PPI网络中连接节点最多的前30个靶点筛选出来作为“芪骨胶囊-PMOP”核心靶点，并绘制出核心靶点条形图。

1.7 GO功能和KEGG通路富集分析

为了进一步明确芪骨胶囊治疗PMOP的分子机制，本研究运用R软件将1.6中获得的“芪骨胶囊-PMOP”核心靶点进行GO(gene ontology)功能和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，并根据富集程度选取排名前20的GO生物过程和KEGG通路分别绘制出条形图。

2 结果

2.1 筛选芪骨胶囊活性成分及相关靶点

本次研究通过检索BATMAN-TCM数据库，共获得芪骨胶囊89个活性成分，对89个活性成分进行靶点预测，并剔除重复靶点后，一共获得558个相关靶点，见表1、表2。

表1 芪骨胶囊成分靶点数量

表2 芪骨胶囊主要活性成分表

2.2 获取PMOP的疾病靶点

2.2.1GEO芯片分析PMOP的疾病靶点：本研究运用通过使用R软件limma包对编号为GSE7158的基因芯片进行二次分析，共得到差异基因479个(上调基因232个，下调基因247个)，选取前40个差异基因绘制出火山图和热图，见图1、图2。

图2 差异基因火山图

2.2.2检索已知的PMOP疾病靶点：在GeneCards数据库中，以“postmenopausal osteoporosis”为关键词，搜索与PMOP相关的疾病靶点，共获得PMOP疾病靶点1 073个，筛选出相关性得分最高的前300个靶点。

2.3 获取“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点

将2.2.1和2.2.2中获得的靶点进行汇总并剔除重复靶点后，与2.1中获得的芪骨胶囊相关靶点取交集，最后得到57个“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点。

2.4 绘制“药物-活性成分-靶点”网络图

通过对芪骨胶囊的药物活性成分及其相对应的潜在靶点与“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点数据进行处理，结果显示57个“芪骨胶囊-PMOP”交集靶点共涉及67个活性成分。使用Cytoscape软件绘制出“药物-活性成分-靶点”网络图，见图3。

图3 “药物-成分-靶点”网络图

2.5 构建“芪骨胶囊-PMOP”PPI网络，筛选核心靶点

通过String在线软件构建得到“芪骨胶囊-PMOP” PPI网络(图4)，图中节点表示芪骨胶囊和PMOP的交集靶点，节点之间的连线表示靶点之间的相互作用关系，连线越多，则该节点在PPI网络中的相互作用关系越强。将该PPI网络中相互作用关系最强的前10个靶点筛选为“芪骨胶囊-PMOP”核心靶点，见图5。

图5 核心靶点条形图

2.6 GO生物过程和KEGG通路富集分析

将芪骨胶囊治疗PMOP的潜在靶点进行GO生物过程和KEGG通路富集分析，根据P<0.05进行筛选，结果得到芪骨胶囊治疗PMOP的作用机制可能与女性怀孕(female pregnancy)、多细胞生物过程(multi-multicellular organism process)等多个生物过程相关，见图6。且这些潜在靶点显著富集于雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、卵巢甾体生成(ovarian steroidogenesis)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素17信号通路(IL-17 signaling pathway)等通道，见图7。

图6 GO生物过程富集分析

图7 KEGG通路富集分析

3 讨论

芪骨胶囊由七味药组成，其用药精简，配伍严密。通过对芪骨胶囊活性成分及靶点的筛选，笔者发现肉苁蓉、菊花、黄芪的的degree值高于其它成分，进一步检索后获得67个主要活性成分与PMOP相关，主要活性成分来源中菊花、黄芪、肉苁蓉的药物靶点数依然位居前三。据韩国植物资源研究所报道[16]，菊花提取物中主要成分α-蒎烯(alpha-pinene)、菊油环酮(chrysanthenone)是有着挥发性香气的化合物，具有增强成骨细胞碱性磷酸酶活性和促进细胞胶原合成及钙沉积的作用。来源于黄芪的β-谷甾醇(beta-sitosterol)、γ-谷甾醇(gamma-sitosterol)均属于甾醇类化合物，具有雌激素样活性，能与机体内的雌激素受体结合产生雌激素样作用[17]。苯丙氨酸(phenylalanine)作为人体必需氨基酸之一，是合成代谢苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides, PhGs)的重要原料。PhGs是肉苁蓉的主要活性成分[18]，其中以松果菊苷为指标性成分[19]。在去卵巢大鼠的实验研究[20]中观察到松果菊苷能改善大鼠股骨骨密度及骨微结构，同时可显著提高骨保护素(OPG)水平，以及降低RANKL受体激活水平，可以有效预防去卵巢诱导的大鼠骨质疏松。在MC3T3-E1细胞体外研究中也显示松果甘油能通过增加OPG/RANNKL比值促进骨再生[21]。

对药物作用靶点进一步聚焦后发现，胰岛素(INS)、白介素-6(IL-6)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等10个靶点是芪骨胶囊治疗PMOP的核心靶点，这表明芪骨胶囊可能是通过以上靶点产生治疗PMOP的作用。INS是人体内分泌的一种可以降低血糖的蛋白质激素，多项研究[22-24]表明INS的使用会导致骨折风险增加、骨密度降低。IL-6是重要的炎症细胞因子,在骨质疏松中起着关键作用[25]。有研究[26]表明炎症是导致PMOP的重要因素之一,IL-6等细胞因子可通过作用于成骨细胞上的受体间接刺激骨吸收。De等[27]通过研究发现IL-6过表达的转基因小鼠表现出骨质减少，骨微结构改变，成骨细胞减少、破骨细胞数量和活性增加等骨质疏松特征。IGFs是骨基质中含量最丰富的生长因子，是维持骨生长的重要调节因子[28],IGF-1水平的下降会导致骨量降低[29]。课题组以往研究显示[13]，芪骨胶囊含药血清对成骨细胞IGF-1的分泌有促进作用，同时会增加成骨细胞的增值率、碱性磷酸酶以及矿化结节数，这可能与芪骨胶囊调控细胞因子IGF-1的表达与分泌有关。上述结果与本研究结果基本一致，凸显了芪骨胶囊通过多靶点调节骨代谢治疗PMOP的特点。

GO生物过程富集分析结果显示，芪骨胶囊治疗PMOP的分子机制与与女性怀孕、多细胞生物过程、维生素D代谢过程、激素氧代谢过程等生物过程相关。KEGG通路富集分析结果显示，潜在靶点主要富集在：雌激素信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、白细胞介素17信号通路。以上研究报道与本研究结果相一致，表明芪骨胶囊通过多通路治疗PMOP的结果具有一定的可靠性。

通过对“药物-成分-靶点-通路”的分析比较，芪骨胶囊治疗PMOP的作用机制可能与菊花、黄芪、肉苁蓉中的主要有效成分如α-蒎烯、菊油环酮、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、苯乙醇苷等有较强相关性，并通过雌激素、白细胞介素等信号通路作用于人体INS、ALB、IL-6、AKT-1、IGF-1等靶点发挥疗效。通过该研究，可为芪骨胶囊治疗PMOP在分子层面提供新的研究方向和思路，对治疗PMOP的用药进行方剂优化及新药研发的理论指导。本次研究基于生物信息学方法探讨了芪骨胶囊治疗PMOP可能的分子机制，但由于网络数据库和所涉及的工具算法等有着一定的局限性，因此具体的分子机制还需要通过严谨周密的实验进行验证。