TLR3活化对人脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

金兵男,江鑫铭,李霄霞,赵春华

(青岛大学基础医学院遗传学与细胞生物学系,山东 青岛 266071)

间充质干细胞(MSCs)是目前国内外研究最多的一类成体干细胞[1-4]，其来源广泛，在脂肪、骨髓、脐带、胎盘等多种成体组织中均广泛存在[5]。其中，人脂肪来源MSCs(hAMSCs)已成为再生医学领域中的理想种子细胞[6-10]。然而，在应用MSCs移植治疗骨质疏松等疾病的过程中常有炎症或细菌感染等情况发生，严重影响了MSCs移植的存活率和治疗效果。因此，寻找MSCs预处理方式，提高MSCs移植存活率，增强体内治疗效果，对MSCs的临床应用具有重要意义[11-13]。Toll样受体(TLRs)作为一类在固有免疫和适应性免疫中具有重要作用的模式识别受体，能够识别大量病原相关分子，介导机体免疫反应，维持机体的平衡状态，MSCs中也有部分表达TLRs[14]。已有研究显示，表达TLR3的MSCs在TLR3被Poly(I:C)活化后表现出抗炎作用，TLRs活化能够对MSCs的成骨分化产生影响[15]。使用Poly(I:C)活化MSCs的TLR3可以作为一种重要的MSCs预处理方法。本研究探讨TLR3活化对hAMSCs增殖及成骨分化的影响，为hAMSCs在骨质疏松等疾病治疗中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

实验所用hAMSCs为吸脂术病人废弃的脂肪组织原代分离扩增获得； DMEM高糖、DME/F12培养基购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于Excell公司；青霉素和链霉素购于新赛美公司；胶原酶P购于美国Roche公司；碱性磷酸酶试剂盒、CCK8试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green Master Mix购于上海翊圣公司；Poly(I:C)、油红O、茜素红购于美国Sigma公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒、磷酸酶抑制剂购于上海雅酶公司；D-hank’s液、PBS、组织裂解液购于北京索莱宝公司；小鼠抗人FITC-CD14、FITC-CD34、FITC-CD45、PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105、FITC-HLA-DR购于美国BD公司。

1.2 hAMSCs的分离培养

取成人吸脂术采集的脂肪组织，D-hank’s液清洗去除血细胞和麻醉药物。加入适量2 g/L胶原酶P，37 ℃恒温摇床消化30 min，100目筛网滤去未消化组织。加入足量D-hank’s液，1 500 r/min离心10 min，弃上清，重复2次。重悬细胞沉淀，接种于hAMSCs培养基中，于含CO2培养箱内37 ℃恒温培养，每3 d换液1次。当细胞生长达到80%融合时，进行传代培养。

1.3 流式细胞术检测免疫学表型

胰蛋白酶消化收集细胞，PBS清洗、重悬，加入相应直标抗体4 ℃孵育30 min，PBS清洗2次，重悬，流式细胞仪上检测MSCs免疫学表型。

1.4 实验分组及细胞增殖检测

取第6代hAMSCs以每孔1×104的密度接种于96孔板中，随机分为两组，对照组不作处理，TLR3组加入20 mg/L Poly(I：C)工作液处理6 h活化TLR3。分别在活化后的0、24和48 h时每孔加入 CCK8工作液10 μL，37 ℃孵育90 min，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(A)值，以其表示hAMSCs增殖能力。

1.5 hAMSCs体外成骨诱导分化及鉴定

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接种于24孔板中，待其生长至80%融合时加入成骨诱导培养基(含体积分数0.10 FBS、 2×10-4mol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM高糖培养基)诱导成骨分化，3 d更换1次新鲜成骨诱导培养基。①碱性磷酸酶染色：成骨诱导3 d后，PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，加入碱性磷酸酶染色工作液，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，光镜下观察对照组和TLR3组hAMSCs碱性磷酸酶活性变化情况。②茜素红染色：成骨诱导12 d后，PBS冲洗2次，用40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，1 g/L茜素红染色工作液室温染色30 min；PBS冲洗3次后，在光镜下观察对照组和TLR3组hAMSCs钙质沉积情况。

1.6 hAMSCs体外成脂诱导分化及鉴定

取第6代hAMSCs，以5×103/cm2的密度接种于24孔板中，待其生长至90%融合时加入成脂诱导培养基(DMEM高糖培养基中含有体积分数0.10 FBS、1×10-6mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸和100 mg/L IBMX)诱导成脂分化，每3 d更换1次新鲜成脂诱导培养基。成脂诱导12 d后，PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，油红O染色工作液室温染色30 min；PBS冲洗3次，光镜下观察hAMSCs脂滴形成情况。

1.7 Real-time PCR检测成骨标志基因runt相关转录因子2(RUNX2)和骨钙素(OCN)mRNA表达

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接种于6孔板中，随机分为TLR3组和对照组，对照组不做处理，TLR3组用含有20 mg/L Poly(I:C)的正常培养基处理6 h，按照总RNA提取试剂说明书提取两组样本的细胞总RNA，应用反转录试剂盒进行反转录，反应条件：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。按照荧光定量试剂盒配制反应体系，反应条件：预变性95 ℃、30 s，变性95 ℃、10 s，退火/延伸60 ℃、30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，2-ΔΔCt法计算hAMSCs成骨标志基因RUNX2和OCNmRNA表达情况。所用基因引物序列见表1。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。

表1 PCR引物及其序列

1.8 Western Blot方法检测相关蛋白表达

细胞按1.7方法分组及处理后，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，蛋白样品应用SDS-PAGE进行电泳分离，然后转蛋白至硝酸纤维素膜上；50 g/L BSA室温封闭90 min，添加一抗(β-actin、GAPDH、RUNX2、OCN、P65、p-P65，1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，添加羊抗兔二抗(1∶5 000稀释)室温孵育60 min， 使用超敏ECL发光液显影，Image J软件分析条带灰度值，以GAPDH或β-actin作为对照，计算目的蛋白RUNX2、OCN、P65和p-P65相对表达量。实验重复3次。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 hAMSCs形态、免疫学表型及成脂成骨分化能力鉴定

在光镜下观察，原代分离培养后的hAMSCs呈长梭形，旋涡状分布，贴壁生长(图1A)；碱性磷酸酶染色后细胞可见蓝色沉淀，表明hAMSCs开始向成骨细胞分化(图1B)；茜素红染色细胞可见染成红色的钙质沉淀，表明hAMSCs成骨诱导12 d后分化为成骨细胞，分泌了大量钙质沉积(图1C)；油红O染色后细胞中可见红色脂滴，表明hAMSCs成脂诱导12 d后分化为脂肪细胞(图1D)。流式细胞术检测hAMSCs的免疫学表型结果显示，CD14阳性率为0.9%，CD34阳性率0.4%，CD45阳性率0.5%，HLA-DR阳性率0.8%，均<5%；CD73阳性率为98.7%，CD90阳性率98.5%，CD105阳性率95.4%，FLK-1阳性率96.0%，均>95%。符合国际细胞学会对于MSCs的定义(图1E)。证明从人脂肪组织中原代分离的细胞为hAMSCs。

2.2 各组hAMSCs增殖能力比较

CCK8法检测结果显示，对照组与TLR3组比较，hAMSCs活化后0、24和48 h时增殖能力差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 两组hAMSCs增殖能力比较

2.3 各组RUNX2和OCN mRNA及蛋白表达的比较

Real-time PCR检测显示，TLR3组RUNX2和OCN的mRNA表达水平均较对照组显著增加(t=14.39、36.36，P<0.01)。Western Blot检测显示，TLR3组RUNX2和OCN蛋白表达均高于对照组(t=3.46、2.98，P<0.05)。见图2A、B和表3。茜素红染色结果显示，TLR3组红色钙质沉积明显多于对照组(图2C)。表明TLR3经Poly(I:C)活化后能够促进hAMSCs成骨分化，加快钙质沉积。

表3 两组RUNX2、OCN mRNA和蛋白表达水平的比较

2.4 各组hAMSCs中NF-κB通路相关蛋白P65及p-P65表达比较

Western Blot结果显示，NF-κB通路相关蛋白p-P65和P65表达较对照组明显增加，差异有统计学意义(t=3.52、13.85，P<0.05)。见图3、表4。

表4 两组P65、p-P65蛋白表达比较

3 讨 论

MSCs作为一类具有自我更新、多谱系分化、低免疫原性和免疫调节能力等多项优点的成体多能干细胞，目前在干细胞领域得到广泛的研究[15]。由于MSCs具有以上多项优点，目前MSCs移植已成为骨质疏松等疾病最佳治疗方法。但是在MSCs移植中经常有炎症或感染情况发生，降低了MSCs移植的成功率与治疗效果，而通过活化MSCs的TLR3介导hAMSCs免疫反应能够抑制炎症感染，提高MSCs移植的成功率和骨质疏松等疾病的治疗效果。但是活化的TLR3是否会影响hAMSCs成骨分化，目前没有定论。本实验结果表明，hAMSCs活化TLR3后，成骨标志基因RUNX2和OCN的mRNA和蛋白表达均明显增加，同时成骨诱导分化后钙质沉积程度更高，表明hAMSCs经Poly(I:C)处理活化TLR3后可能促进hAMSCs成骨分化。

MSCs在成骨分化过程中受到多种信号通路的调控，包括Wnt信号通路、Notch信号通路、BMP/TGF-β信号通路、MAPK信号通路、hedghog信号通路、FGF信号通路、PTH信号通路和IGF-1信号通路等[16-19]，不同信号通路通过调控β-catenin、同源核蛋白MSX2和含有PDZ识别模体的转录辅助激活因子TAZ等因子的表达，上调成骨分化标志基因RUNX2和其下游基因OSX(osterix)的表达，提高碱性磷酸酶活性，调控成骨细胞特异性细胞外基质蛋白OCN表达和钙离子沉积，促进MSCs向成骨细胞分化[20-21]。大量的研究结果证明，许多因素都能够通过不同信号通路影响MSCs的成骨分化[22-28]，其中TLRs活化对MSCs的成骨分化也有影响。例如使用LPS持续刺激骨髓来源MSCs活化TLR4后能够通过Wnt通路促进其增殖和成骨分化[29]。TLR2活化后也能够显著增强骨髓来源MSCs的成骨分化[30]。TLR9活化后能够促进脐带来源MSCs成骨分化而不影响其表型[31]。本实验结果显示，Poly(I:C)活化hAMSCs的TLR3后，NF-κB通路相关蛋白P65和p-P65表达明显增加，表明hAMSCs的TLR3活化后可能通过激活NF-κB通路来上调成骨标志基因RUNX2和OCN的表达，促进hAMSCs成骨分化。但是具体作用机制仍不明确，需要进一步探讨。

综上所述，Poly(I:C)活化hAMSCs的TLR3后，能够通过激活NF-κB通路上调hAMSCs成骨标志基因RUNX2和OCNmRNA和蛋白表达，加快钙质沉积，促进hAMSCs成骨分化。因此，活化hAMSCs的TLR3不仅能够抑制炎症，提高MSCs的移植存活率，还能够促进MSCs的成骨分化，加快钙质沉积，有利于增强骨质疏松病人的骨修复能力，为一种可行的MSC预处理方式。但是活化TLR3后促进MSCs成骨分化涉及的基因及信号通路需要进一步研究[32-33]。本文研究结果可为hAMSCs在骨质疏松等老年退行性疾病中的应用提供了一定的研究基础。