六倍体小黑麦株高分离的染色体构成分析

王贝麟，陈麒帆，门文强，田修斌，苗敬南，贺金秋，赵月，李欢欢，刘文轩

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

普通小麦(TriticumaestivumL.,2n=6x=42,AABBDD)是中国乃至世界上最重要的三大粮食作物之一，种植面积约占谷类作物种植总面积的1/3[1]。在中国，小麦是重要的粮食作物之一，在国家粮食安全和社会稳定中起着十分重要的作用。近年来，随着人口数量的不断增加，人均耕地面积的日益减少，气候的异常变化，使得普通小麦对生物和非生物抗性以及产量等要求越来越高。

遗传基础狭窄是影响普通小麦进行遗传改良的根本问题，向普通小麦导入外源优异基因是丰富遗传基础的有效途径[2-3]。小麦野生近缘物种类型繁多，变异多样，具有丰富的遗传多样性，蕴藏着丰富的多花、多粒和优质蛋白质等高产优质基因，以及抗病虫等生物胁迫和耐寒、耐旱等非生物胁迫基因[4-5]。通过远缘杂交和染色体工程等遗传操作将这些优异基因导入普通小麦，不仅可以极大丰富小麦基因资源，同时也有助于扩大小麦育种的遗传基础。

黑麦属于禾本科黑麦属(SecalecerealeL., 2n=2x=14,RR)草本植物，携带大量抗病、抗逆、高产和广适应性等优良基因，是普通小麦遗传改良的重要基因资源[6-8]。黑麦Petkus的1RS染色体上携带有抗白粉病基因Pm8，抗叶锈病基因Lr26，抗秆锈病基因Sr31和抗条锈病基因Yr9[9-10]。黑麦German White的4R染色体上携带有抗白粉病基因[11]。黑麦Prolific的6RL染色体上携带有抗白粉病基因Pm20[12]。黑麦Baili的7R染色体长臂上携带有抗白粉病基因、抗条锈病基因、抗小麦赤霉病基因[1]。因此，黑麦在增加小麦的遗传多样性，培育抗病高产优良小麦品种方面具有很大的应用潜力。

小黑麦是通过小麦属和黑麦属物种间杂交、杂种F1经染色体加倍而人工合成的新物种。目前，小黑麦主要有八倍体小黑麦(2n=8x=56,AABBDDRR)和六倍体小黑麦(2n=6x=42,AABBRR)2种类型。其中六倍体小黑麦是四倍体硬粒小麦(2n=4x=28,AABB)与黑麦杂种F1经染色体加倍获得的新物种，由小麦的A和B基因组以及黑麦的R基因组所有染色体组成[13]。六倍体小黑麦既保持了普通小麦的高产和优质的特性，又结合了黑麦的抗病、耐旱、耐寒和赖氨酸含量高等优良特性，在生产上具有广泛的应用价值[14]。但是，六倍体小黑麦广泛存在植株极高、容易倒伏的缺点。引入主效矮化基因是植物育种家克服株高问题最简单的方法，但是，此方法对于六倍体小黑麦不如小麦那样有效[15]。因此，通过解析六倍体小黑麦株高原因，为进一步利用现代分子生物学手段降低六倍体小黑麦株高提供新方法。

本研究发现六倍体小黑麦84(184)自交后代分离出高秆﹑中高秆和矮秆3种株高类型，利用原位杂交和黑麦染色体特异分子标记对六倍体小黑麦84(184)不同株高及其自交后代材料进行鉴定，分析六倍体小黑麦84(184)不同株高材料染色体构成，并初步解析株高发生分离原因，为利用分子生物学手段降低小黑麦植株高度奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括普通小麦中国春(2n=6x=42,AABBDD)，黑麦(2n=2x=14,RR)，六倍体小黑麦84(184)及其后代高秆株系84(184)-249-2、84(184)-251-3和84(184)-253-7，中高秆株系84(184)-250-3和84(184)-251-5，矮秆株系84(184)-249-3和84(184)-253-1。小黑麦84(184)是河南天民种业有限公司从国际玉米小麦改良中心的六倍体小黑麦MZAleondBeer与宝丰7228的杂交后代选育出的六倍体小黑麦。以六倍体小黑麦84(184)为中间材料，育成了豫麦66(兰考906)等兰考系列超高产多抗小麦新品种[16]。六倍体小黑麦及其不同株高材料由河南天民种业有限公司提供，六倍体小黑麦不同株高自交后代材料和黑麦由河南农业大学生命科学学院染色体与基因工程实验室繁殖保存。

1.2 农艺性状调查

2017—2018和2018—2019年度，于河南农业大学科教示范园区种植所有供试材料，种子单粒穴播，行长2.00 m，株距0.10 m，行距0.30 m。3行区，重复3次，四周设置保护行。常规田间管理，所有材料均未发生倒伏。在小黑麦乳熟期，参考ZADOKS等[17]的方法调查小黑麦84(184)不同株高植株和自交后代材料的株高，并记录数据。

1.3 细胞学鉴定

小麦根尖细胞有丝分裂中期染色体制片参照HUANG等[18]的方法。将待检测植株种子置于垫有2层滤纸的培养皿，加水至浸没种子，于24 ℃培养箱中发芽。待主根长至1.5～2.0 cm时，将0.2 μmol·L-1APM(Methyl Glyphosate)倒入培养皿浸没种子24 ℃继续培养2 h。用清水冲洗种子3次后剪取种子根，放入N2O罐中处理2 h，将根置于90%乙酸固定10 min，最后放入70%的乙醇置冰箱中保存备用。2～7 d后在45%的乙酸中压片。

基因组原位杂交参照LIU等[19]的方法。用绿色荧光素(fluorescein-12-dUTP)标记的黑麦基因组DNA作探针，普通小麦中国春基因组DNA作封阻，探针∶封阻=1∶40，对小麦背景下的黑麦外源染色体进行检测。在Zeiss Axio Scope A1荧光显微镜下观察，AxioCam MRc5 CCD照相、保存。

1.4 分子标记鉴定

取试验材料的两叶一心期幼叶，采用CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide)方法提取基因组DNA[20]。黑麦1R～7R染色体臂特异分子标记参考LI等[21]和DAI等[22]提供的分子标记(表1)。15.0 μL的PCR反应体系包含2.0 μL基因组DNA(200 mg·L-1)、7.5 μL Taq MasterMix、上下游引物各1 μL(5 μmol·L-1)、3.5 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，63 ℃退火20 s，每个循环降低0.5 ℃，72 ℃延伸2 min，10个循环；94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃最后延伸 10 min。

表1 黑麦1R-7R染色体臂特异分子标记 Table 1 Rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers

分子标记TNAC1048，TNAC1685和TNAC1834的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ在37 ℃酶切3.5 h。分子标记TNAC1019和TNAC1943的PCR产物用限制性内切酶TaqI在65 ℃酶切3.5 h。5.0 μL酶切反应体系包括2.85 μL ddH2O，2.0 μL CutSmart buffer，0.15 μL限制性内切酶。PCR产物和酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，最后在全自动凝胶成像系统中扫描。

1.5 数据分析

用Microsoft Excel 2013和SPSS 20.0软件进行方差分析和平均数、标准差和变幅的计算，并采用最小显著极差法(shortest significant range,LSR)比较株高差异显著性。

2 结果与分析

2.1 六倍体小黑麦84(184)后代不同株系的株高分析

对84(184)后代不同株系的株高进行测量分析，发现不同株系之间株高差异很大。其中矮秆株系84(184)-249-3和84(184)-253-1无株高分离，平均植株高度分别为39.7和37.5 cm。高秆株系84(184)-249-2，84(184)-251-3和84(184)-253-7株高均无分离，分别达到79.1，88.4和78.9 cm。中高秆株系84(184)-250-3和84(184)-251-5出现高﹑中高和矮秆分离，前者高﹑中高和矮秆植株分别为51，83和30株，后者高﹑中高和矮秆植株分别为48，80和29株；所分离的中高秆植株的平均株高分别为58.2和56.0 cm，而高秆和矮秆植株平均株高分别与高秆和矮秆株系相同。方差分析和多重比较发现，小黑麦84(184)不同株高类型材料之间的株高存在显著差异，依次相差20 cm左右(表2)。

表2 六倍体小黑麦84(184)后代不同株系的株高分析Table 2 Analysis of plant height of different progeny lines of hexaploid triticale 84(184)

2.2 小黑麦84(184)不同株高材料GISH鉴定结果

为了分析小黑麦84(184)不同材料株高差异原因，利用GISH技术对84(184)不同株高植株根尖细胞进行了细胞学鉴定。结果发现，高秆植株细胞共有42条染色体，其中小麦染色体28条，黑麦染色体14条(图1A)；中高秆植株41条染色体，包含28条小麦染色体和13条黑麦染色体，缺少了1条黑麦染色体(图1B)；而矮秆植株40条染色体，包含28条小麦染色体和12条黑麦染色体，缺少了2条黑麦染色体(图1C)。

黑麦基因组DNA探针标记为绿色信号，小麦染色体由DAPI复染为蓝色。A：六倍体小黑麦高秆植株84(184)-249-2 (2 n=42)，B：六倍体小黑麦中高秆植株84(184)-250-3 (2 n=41)，C：六倍体小黑麦矮秆植株84(184)-249-3 (2 n=40)。Rye genomic DNA was labeled with fluorescein-12-dUTP and visualized with green fluorescence.Wheat chromosomes were counterstained with 4,6-diamino-2-phenyl indole (DAPI) and visualized with blue fluorescence.A:hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height (2 n=42),B:hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height (2 n=41),C:hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height (2 n=40).

为了分析小黑麦84(184)中高秆植株和矮秆植株缺少的黑麦染色体归属，首先利用LI等[21]和DAI等[22]开发的黑麦染色体分子标记，对中国春和黑麦基因组DNA进行分子标记检测，从中筛选出了14个黑麦1R～7R染色体长﹑短臂特异的分子标记(表1)。利用筛选到的14个黑麦1R～7R染色体长短臂特异分子标记，对小黑麦矮秆植株、中高秆植株和高秆植株进行鉴定。发现14个黑麦染色体长臂和短臂特异分子标记在小黑麦84(184)高秆植株和中高秆植株中均能扩增出特异条带(图2)。但是，在矮秆植株中，除黑麦2R染色体短臂特异分子标记CMS2R-14和长臂特异分子标记TNAC1142无目的条带扩增外(图2C～D)，其余12个特异分子标记均能扩增出特异条带(图2)。因此，矮秆植株细胞中缺少的2条黑麦染色体是1对2R染色体。由此推断黑麦2R染色体上应该携带有控制株高的基因。

M：100 bp ladder DNA marker；1：中国春；2：六倍体小黑麦矮秆植株84(184)-249-3；3：六倍体小黑麦中高秆植株84(184)-250-3；4：六倍体小黑麦高秆植株84(184)-249-2。A～N：黑麦1R-7R染色体长短臂特异分子标记。TNAC1048/HaeⅢ(1RL)，TNAC1019/TaqI(1RS)，CMS2R-14(2RS)，TNAC1142(2RL)，TNAC1248(3RS)，TNAC1267(3RL)，TNAC1457(4RS)，TNAC1943/TaqI(4RL)，TNAC1497(5RS)，TNAC1541(5RL)，TNAC1685/HaeⅢ(6RS)，TNAC1702(6RL)，TNAC1623(7RS)，TNAC1834/HaeⅢ(7RL)。箭头表示黑麦染色体臂特异分子标记扩增结果。M:100 bp ladder DNA marker；1:wheat landrace Chinese Spring；2:hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height；3:hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height；4:hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height.A-N:Rye 1R-7R chromosome-arm specific molecular markers TNAC1048/HaeⅢ(1RL).TNAC1019/TaqI (1RS),CMS2R-14(2RS),TNAC1142(2RL),TNAC1248(3RS),TNAC1267(3RL),TNAC1457(4RS),TNAC1943/TaqI (4RL),TNAC1497(5RS),TNAC1541(5RL),TNAC1685/HaeⅢ(6RS),TNAC1702(6RL),TNAC1623 (7RS),TNAC1834/HaeⅢ (7RL),respectively.Arrows indicate the polymorphic results of rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers.

本研究利用14个黑麦1R～7R染色体长短臂特异分子标记对小黑麦84(184)高秆、中高秆和矮秆植株自交后代进行了进一步分析。结果发现，高秆植株后代均可以扩增出14个1R～7R黑麦染色体臂特异分子标记的目的条带(图3)；在矮秆植株后代，黑麦2R染色体短臂特异分子标记CMS2R-14和长臂特异分子标记TNAC1142均不能扩增出目的条带，而其余12个黑麦染色体臂特异的分子标记均能扩增出目的条带(图3)；在中高秆植株自交后代中，黑麦1R和3R～7R染色体臂特异的12个分子标记均能扩增出目的条带，而黑麦2R染色体短臂特异分子标记CMS2R-14和2R染色体长臂特异分子标记TNAC1142则发生分离(图3)。对小黑麦84(184)不同株高植株自交后代的分子标记分析进一步确定小黑麦84(184)的株高分离和2R染色体有关，包含1对黑麦2R染色体植株表现高秆；只包含1条2R染色体的单株为中高秆；而缺少1对2R染色体的植株则表现为矮秆。

M：100 bp ladder DNA marker；1～6：六倍体小黑麦矮秆植株84(184)-249-3后代；7～13：六倍体小黑麦中高秆植株84(184)-250-3后代；14～24：六倍体小黑麦高秆植株84(184)-249-2后代。A～G：部分黑麦1R-7R染色体长短臂特异分子标记TNAC1019/TaqI(1RS)，TNAC1142(2RL)，TNAC1248(3RS)，TNAC1943/TaqI(4RL)，TNAC1497(5RS)，TNAC1702(6RL)，TNAC1623(7RS)。箭头表示黑麦染色体臂特异分子标记扩增结果。M:100 bp ladder DNA marker；1-6:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height；7-13:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height；14-24:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height.A-G:Rye 1R-7R chromosome-arm specific molecular markers TNAC1048/HaeⅢ (1RS),TNAC1142 (2RL),TNAC1248 (3RS),TNAC1943/TaqI (4RL),TNAC1497 (5RS),TNAC1702 (6RL),TNAC1623 (7RS),respectively.Arrows pointed to the polymorphic bands of rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers.

3 结论与讨论

随着外源物种成功地转移至小麦，准确、快速和高效地鉴定小麦背景中的外源染色质显得格外重要。利用基因组原位杂交技术可以成功检测小麦背景下多种外源的染色体或染色体片段。LI等[23]利用基因组原位杂交技术成功鉴定出39个小麦-冰草2P异源易位系。随着分子生物学的快速发展，目前鉴定小麦背景中外源染色质的方法趋向于分子标记，因其不受环境和生育期的限制、且简单易操作、成本低、效率高等优点，被越来越多地应用于小麦背景中外源物质的检测[24]。LI等[25]结合原位杂交和簇毛麦6V染色体长臂特异分子标记成功鉴定到6个小麦-簇毛麦易位系。本研究发现六倍体小黑麦84(184)后代不同株系株高存在着显著差异。为了解析株高分离原因，综合原位杂交和黑麦1R～7R染色体特异分子标记，对84(184)不同株高类型材料鉴定分析，发现84(184)矮秆植株缺失了1对2R染色体，为2R缺体，中高秆植株仅有1条2R染色体，为2R单体，高秆植株含有1对2R染色体，为2R二体。

六倍体小黑麦兼具小麦优质高产以及黑麦抗性强等特点，同时小黑麦植株高大，生物产量高，也是优良的饲草和潜在的能源作物[26]。但是植株过高容易倒伏，不仅不利于机械化收割，还进一步导致产量降低和品质受损[27]。引入主效矮化基因是降低株高最简单的方法，但这一方法对六倍体小黑麦的矮化效果有限，且存在与种子皱瘪等不良农艺性状关联问题[28]。因此，解析六倍体小黑麦株高的遗传与分子基础，可以为降低小黑麦株高、提高其利用价值提供参考依据。本研究通过对六倍体小黑麦不同株高类型鉴定分析，发现六倍体小黑麦84(184)中的2R染色体与植株高度有密切关系。缺少1条黑麦2R染色体可导致植株高度平均降低25.0 cm，降低30.45%；而缺少1对黑麦2R染色体可致使株高平均降低43.1 cm，降低52.98%，因此，推断2R染色体上携带有对株高起正向叠加效应的不完全显性基因。该基因的缺失可以显著降低小黑麦植株的高度。

总之，本研究综合原位杂交和黑麦染色体特异分子标记对六倍体小黑麦84(184)不同株高材料鉴定分析，发现2R染色体上携带有正向影响株高的不完全显性基因。本研究对黑麦2R染色体携带的株高控制基因进行定位与克隆进一步研究提供理论依据，通过分子生物学手段还可为降低小黑麦植株高度奠定基础。