副溶血弧菌检测方法的研究进展

贾晨 王丹 王琪 刘磊 曲连海 周琦

摘 要：本文介绍了副溶血弧菌的传统检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法等几种快速的检测方法，通过对多种检测方法的优缺点进行分析，为食品行业中副溶血弧菌的检测方法选择方面提供理论依据。

关键词：副溶血弧菌;培养法;免疫学检测;分子生物学检测

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种革兰氏阴性嗜盐性弧菌[1]，常在河口、海底沉积物等海洋环境中，以及鱼贝类等海产品中检出较多[2]。副溶血弧菌不仅严重危害海水养殖业，还能引发人类胃肠炎、食物中毒等，是一种条件致病菌[3]。近年来，由于误食受副溶血弧菌污染或加工不当的海产品而导致的食物中毒事件层出不穷，在我国部分沿海地区，细菌性食物中毒位居首位[4-5]。通过对副溶血弧菌的快速检测，可以有效防止相关疾病的传播和发生。近年来，对副溶血弧菌检测方法的研究取得了较大的进展，本文主要通过对多种检测方法的优缺点进行分析，为检测方法的选择提供理论基础。

1 培养法

目前，传统的培养方法是国家标准对于副溶血弧菌的检测[6]，根据检测需求，分为定性检测和定量检测。取样品25 g置于3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）中，分别进行定性的增菌和定量的梯度稀释后，接种到TCBS或弧菌显色培养基中。挑取可疑菌落，进行生理生化鉴定，如氧化酶试验、革兰氏染色镜检、三糖铁试验、嗜盐性试验、生化鉴定、血清学试验、神奈川试验等，整体操作时间过长，涉及到的试验方法以及试剂过多，易造成检测结果出错。

1.1 显色培养基

显色培养基是近些年逐步应用在检测行业的传统培养基代替品，它是一类由目标微生物的代谢产物中的酶，与特异性的酶显色底物进行反应，显色酶底物与微生物代谢酶相结合，显色基团游离进而显色的原理，检测目标微生物的新型培养基。与传统的培养基相比，显色培养基具有较高的灵敏度和特异性。OLIVIA等[7]使用弧菌的显色培养基和传统培养基对于河口不同季节的水样进行测定，通过对菌株的测序，验证了传统培养基对创伤弧菌的假阳性率有2%，霍乱弧菌的假阳性率为19%，而副溶血弧菌的假阳性率达到59%。弧菌的显色可以显著降低假阳性率2～5倍。EDDABRA等[8]对96个粪便和拭子样本进行测试，通过显色培养基和TCBS（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基）对比发现，霍亂弧菌在显色培养基的检出率为34%，在TCBS中的检出率为31%。对霍乱弧菌和副溶血弧菌的特异性进行检测，显色培养基的特异性达到100%，而TCBS的特异性只有93.33%。显色培养基的特异性明显高于TCBS。

1.2 微生物测试片

微生物测试片是预制型的培养基，采用快速扩散技术、新一代微生物显色等创新技术，可实现菌落的快速增殖和判读，提高实验室的检测效率。许如苏等[9]以副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌等49株标准菌对测试片的敏感性、特异性和可重复性进行检测。结果表明，副溶血弧菌在测试片上表现为紫色菌落，其他非目标微生物显示蓝色或者不生长;重复性试验结果相对偏差偏低，检测结果良好。但是由于需要考虑实际样本中的副溶血弧菌的检测以及样品的适应性等多种因素干扰，有较高的难度。

2 免疫学检测方法

免疫学检测方法主要有酶联免疫法吸附法、血清型法、免疫荧光技术、免疫扩散技术、免疫胶体金技术和免疫印迹技术等[10]。它们主要的原理是应用抗原和抗体的特异性进行检测。但是免疫学检测方法对于抗体的特异性要求较高，同时最低检出限偏高，导致漏检的可能性。

2.1 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是采用抗原抗体相结合的原理，以胶体金作为标志物的一种免疫标记技术。朱慧等[11]制备了兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，并对其效价进行测定，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白，确定4种标记蛋白的浓度，以及抗原蛋白的特异性检测。检测结果表明胶体金试纸条准确鉴定出副溶血弧菌，排除其他非目标菌的交叉反应干扰，对人工感染的结果可以进行准确判断。

2.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法简称ELISA，是酶联免疫中应用较广的免疫测定技术。其原理是抗原或抗体固定在载体表面，在载体表面发生抗原抗体反应，酶与底物发生显色反应，洗涤后，可通过吸光值进行检测。ELISA方法可以进行定性或者定量的分析。李国等[12]从濒死的文蛤中分离鉴定出一株副溶血弧菌，并用该菌苗制备兔抗血清，以HRP-羊抗兔IgG为酶标二抗，对人工感染副溶血弧菌的样本进行ELISA检测。结果显示，采用间接ELISA技术检测副溶血弧菌，人工污染的文蛤样本副溶血弧菌的检出率为80%，健康文蛤样本的副溶血弧菌检出率为15%。结果表明ELISA检测法可以用于发病文蛤的检测，但还是有假阴性存在。

3 分子生物学检测方法

3.1 PCR方法

随着分子生物学的飞速发展，PCR的方法已经被逐渐的写入标准中。PCR方法（Polymerase chain reaction，PCR），又称聚合酶链式反应，是一种通过温度控制可实现体外扩增特异DNA片段的技术。PCR检测具有灵敏度高、特异性强等优势。KIM等[13]基于toxR基因的PCR方法检测副溶血弧菌，采用28个目标和非目标菌株建立了PCR检测方法，通过494株菌株检测目标菌株的特异性。结果75.5%的副溶血弧菌较强的特异性，非目标菌株没有得到扩增。PCR检测方法虽然灵敏度较高，但是过于依赖目标基因的分离和富集，且易受到程序设置的干扰。

3.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、重复性好、准确性高等优点。王建昌等[14]根据已知的副溶血弧菌基因组序列，筛选特异性靶基因，设计特异性引物探针，优化反应体系，并在体系内加入内参（IAC），通过标记不同荧光基团的Taqman探针来监测IAC，进而实时监控整个PCR反应。建立gyrB-IAC相关标准曲线，Ct值与拷贝数有良好的线性关系;人工污染的初始菌量为7 cfu/25 g，样品增菌6 h后，副溶血弧菌即可检出。胡兴娟等[15]针对副溶血性弧菌tlh基因，沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和TaqMan探针，建立3种致病菌的多重荧光定量PCR检测体系，并对海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的进行检测。结果3种目标致病菌均可得到特异性扩增，而其他非目标细菌均未见特异性扩增曲线。该体系对副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的最低检测限均小于

100 cfu/mL。并对150粉实际样本进行检测，与国家标准法检出率一致。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增方法，其特点是在链置换特异的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，设计4种特异引物，进行60～65 ℃恒温扩增，15～60 min即可实现核酸扩增，具有操作简单、特异性强等特点。反应过程中加入染料等，在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，只需肉眼观察产物中的浊度即可，操作过程简单，结果易判读。胡元庆等[16]用tlh基因作为副溶血弧菌的靶向基因，设计了4条引物，优化LAMP检测方法中的反应体系和反应条件。体系用Bst DNA聚合酶催化，恒温反应60 min，产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定，对各项反应参数进行优化;将菌液的10倍稀释液进行LAMP和PCR反应，并对32株食源性病原菌进行LAMP扩增，验证其特异性;结果显示，确定25 μL体系中Mg2+浓度为3.6 mmol/L，dNTPs浓度为0.96 mmol/L，聚合酶用量为4.8 U，内外引物浓度比为8∶1，最佳反应温度为63 ℃，时间为60 min;LAMP的最低检测限明显低于PCR检出限;对32个菌株进行特异性检测，阳性率为100%，说明LAMP具有较高的特异性。

3.4 重组酶聚合酶等温扩增技术

重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是可以替代传统PCR的核酸检测技术，是新一代的等温扩增核酸检测技术。RPA技术基于重组酶聚合酶，且最佳反应温度在20～37 ℃，20 min内完成扩增反应。刘小青等[17]采用RPA技术，建立了以irgB为靶基因的RPA-exo副溶血弧菌的引物探针，对引物探针进行组合筛选，建立RPA-exo荧光探针快速检测方法，

15 min可完成检测，具有高特异性，无交叉反应，灵敏度较高;人工污染样品加入终浓度为1.36×103 CFU/mL时，无需增菌即可被检出;实际样品检测检测结果与GB 4789.7—2013结果一致。

4 结语

副溶血弧菌的检测方法各有优缺点。传统国家标准检测方法要经过培养基的基础培养，挑取可疑菌落分离、增菌、镜检和生化鉴定等烦琐步骤;显色培养基和微生物测试片使用方便，但需要具有特异性较高的酶底物。免疫学检测方法对于抗体的特异性要求较高，同时最低检出限偏高，导致漏检的可能性。分子生物学检测方法具有灵敏度高、重复性好、反应高效、准确性高等优势，但是过于依赖目标基因的分离和富集，且容易受到程序设置的干扰。

食品中副溶血弧菌检测方法有传统检测方法、实时荧光定量PCR、LAMP、RPA 和MPCR-DHPLC法等，并可以多种结合进行目标菌株鉴定。多種检测方法相结合，融合多种优势，如LAMP技术与生物传感器技术相结合，酶联免疫磁珠技术与PCR技术相结合，MALDI-TOF MS与16S rRNA鉴定相结合。基因芯片技术融合了PCR、纳米芯片和探针杂交。

上述针对副溶血弧菌的相关检测方法，无论是从科学调查角度还是食品安全角度来说，对副溶血弧菌的有效检测都存在着重要的研究意义。这些方法存在着一些不可忽视的问题，应当综合考虑各检测方法优劣势，在多项技术的基础上建立可以满足多方面需求的快速、高效、经济的检测方法，才能实现副溶血弧菌的有效检测，保障食品安全。

参考文献

[1]金培婕，吴蓓蓓，王淑娜，等.浙江沿海地区海产品及环境中副溶血弧菌的分离与主要毒力基因分析[J].微生物学通报，2009，36（7）：962-967.

[2]WANG L，SHI L，SU J，et al.Detection of Vibrio parahaemolyticus in food samples using in situ loop - mediated isothermal amplification method[J].Gene，2013，515（2）：421-425.

[3]McPherson V L，Watts J A，Simpson L M，et al.

Physiological effects of the lipopolysaccharide of Vibrio parahaemolyticus on mice and rats[J].Microbios， 1991，67：272-273.

[4]刘秋爽.副溶血弧菌引起食物中毒调查[J].医疗装备，2018，31（1）：71-72.

[5]庞璐，张哲，徐进，等.2006-2010年我国食源性疾病暴发简介[J].中国食品卫生杂志，2011，23（6）：560-563.

[6]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验：GB/T4789.7—2013[S].北京：中国标准化出版社，2013.

[7]OLIVIA D N，GRIEG F S.Differential specificity of selective culture media for enumeration of pathogenic vibrios： Advantages and limitations of multi-plating methods[J].Journal of Microbiological Methods， 2015（111）：24-30.

[8]EDDABRA R， PIEMONT Y，SCHEFTEL J M.Evaluation of a new chromogenic medium， chromID? Vibrio， for the isolation and presumptive identification of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens[J].European Journal of Clinical Microbiology， 2011，30（6）：733-737.

[9]许如苏，林彩华，黄桂荣，等.副溶血性弧菌快速测试片检测性能研究[J].中国卫生检验杂志，2008（18）：2621-2623.

[10]殷蓓琦，黄秋芳.三种不同免疫检测法对乙肝血清学标志物检测的结果对比分析[J].标记免疫分析与临床，2017，24（6）：682-685.

[11]朱慧，李嘉文，绳秀珍，等.副溶血弧菌胶体金快速检测试纸的研制及应用[J].中国海洋大学学报（自然科学版）.2021，51（3）：24-33.

[12]李国，闫茂仓，常维山，等.文蛤副溶血弧菌间接ELISA检测技术的研究[J].海洋通报，2008（5）：85-90.

[13]KIM Y B，OKUDA J，MATSUMOTO C，et al.Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J].Journal of Clinical Microbiology，1999，37（4）：1173-1177.

[14]王建昌，王金凤，李静，等.基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J].中国食品卫生杂志，2015，27（4）：408-413.

[15]胡兴娟，沈飚，余辉，等.多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌[J].中国食品卫生杂志，2016，28（4）：440-444.

[16]胡元庆，黄玉萍，李凤霞，等.水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化[J].现代食品科技，2017，33（6）：313-320.

[17]刘小青，严琼英，陈国培，等.RPA等温扩增技术检测副溶血性弧菌[J].食品工业科技，2020，41（1）：112-118.