PCR检测技术在食品微生物检测中的应用

2021-09-09洪亮

食品安全导刊·中旬刊 2021年7期

洪亮

摘要：PCR作为分子生物学的基础技术，已经在环境工程、食品工程、医药行业等众多领域得到了较为广泛的应用。目前，多项食品安全国家标准中在微生物鉴定环节也已引入PCR检测方法。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准、中华人民共和国农业行业标准等多项标准引用该方法。本文就传统微生物检测方法存在的问题引出对各项PCR检测技术在食品微生物检测中的应用现状进行列举分析，提出各检测方面的实际用途以及优缺点，以期为未来的PCR检测技术发展提供方向。

关键词：聚合酶链式反应;食品;检测

1 传统微生物检测方法存在的问题

每年夏季都是食源性疾病高发期，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中较为常见的致病菌，易引发人畜疾病，应进行严格质检，确保食品安全。目前，食品微生物检测的国家通用标准主要为GB 4789系列，共计40多个标准方法，大部分标准方法都是采用培养法进行检测分析。少数标准方法，例如GB 4789.6中致泻大肠埃希氏菌检验、GB 4789.42中诺如病毒检验等采用了聚合酶链反应（PCR）法。传统检测方法（培养法）的一般流程为样品称量、增菌（预培养）、分离纯化、生理生化鉴定、菌株血清分型等，菌落形态观察、菌株生化鑒定及血清学分型等冗繁的操作历时较长，对培养基和培养条件要求也较严苛，易导致漏检，且无法满足部分厂商要求的快速检测周期，不利于及时发现问题、解决问题。此外，部分检测用试剂毒性较大，对检测人员身体健康也容易造成威胁。同时，对于新冠病毒等不便于培养的微生物来说，传统的检测方法也无从解决检测需求。

近年来，随着分子生物学检测技术的快速发展，微生物检测的方法也日趋多元化、现代化。流式细胞仪、PCR仪（Real-time PCR、RT-PCR等）、酶联免疫吸附法和免疫层析测定等多种较新的检测方法或仪器的加入[1]，也使得食品微生物检测的灵敏度、特异性和检测速度得到了极大的提升，这些更为快捷、准确的检测技术也更能适应人们对食品产品质量的要求。

2 PCR检测技术在食品微生物检测中的应用现状

PCR又称聚合酶链式反应，是通过仪器和试剂在体外模拟天然DNA复制的过程，可在较短时间内获得大量目的基因片段，再通过琼脂糖凝胶电泳和荧光检测技术等对目的片段进行分析确认，最终可实现对食源性微生物进行准确的定性分析。目前PCR作为分子生物学基础技术，目前已经在环境工程、食品工程、医药行业等多领域得到了较为广泛的应用[2]，特别是新冠疫情爆发之后，基于PCR技术的分子生物学检测技术得到了更为广泛的应用，尤其是在医药领域及鲜活农产品及食品领域的应用较之前更为频繁。

PCR检测技术在食品微生物检测中的应用与其在其他领域的应用类似，需要特异性的引物与靶序列进行结合引导反应的开始，整个反应包括DNA模板的变性解链、复性（或称退火）模板与引物结合、子链延伸等过程的不断循环，实现DNA的指数级增长，最终在短时间内获得更多的目的DNA片段，用于后续的凝胶电泳和基因测序等分析，以确定扩增DNA的具体序列信息。PCR检测技术非常适用于对生长条件要求特殊，不容易实现常规增菌培养的微生物的检测、鉴定和分型。较常采用的有常规PCR技术、实时荧光定量PCR技术、RT-PCR检测技术以及基于PCR的基因芯片检测技术等4种[3]。

目前在食品领域这4种检测技术不仅可用于微生物检测，还能应用在疫病检测、食品种质资源鉴定、食物中转基因成分检测、食物中过敏源成分检测、药食同源样品基源鉴定和产品真伪鉴别等方面。

2.1 常规PCR技术在食品微生物检测中的应用

常规PCR技术在食品微生物检测中的应用一般用于同时检测多种食源性微生物以及对分离纯化后的微生物进行菌种鉴定等领域。前者主要通过在反应体系中同时加入多种致病微生物的特异性引物以实现多个目的基因片段同时扩增，共同分析，缩短检测周期、缩减检测费用的目标。后者主要用于提高传统检测方法的准确率，防止漏检、错检，也适用于对未知菌株进行鉴定分型，为食品生产实践过程中准确分析污染源和制定针对性的除菌措施提供指导方向[4]。但是常规PCR技术虽然造价较便宜，应用最为广泛，但是也只能单纯的用作基因扩增，后续的基因分析还需要借助电泳技术、荧光检测技术或测序技术才能达到最终的检测目标。而且在后续染色环节还会用到溴化乙锭，易对检测人员的身体健康造成威胁。

2.2 实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测中的应用

实时荧光定量PCR技术，是在常规PCR的基础上，在反应体系中加入荧光信号再利用仪器对信号进行监测，从而实现对起始模板进行定量和定性分析的方法。利用该技术对食品微生物进行分析，可以避免在检测过程中的交叉污染，也省去了后续溴化乙锭等有毒物质染色及紫外荧光检测等步骤，自动化程度更高，特异性更强。当前，食品中多种致病菌检测以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量检测都可采用该方法[5]，虽然设备成本相对较高，但是节省人力，且更为精准，目前应用较为广泛[6-8]。

2.3 基于PCR的基因芯片检测技术

基因芯片是目前较先进的一种高通量核酸分子杂交技术，它通过原位合成或显微打印技术将核酸分子探针按照拟定的顺序固定到固相介质芯片的表面，在将样品的核酸分子提取经PCR扩增后与该具有高密度的寡核苷酸阵列的芯片上的探针进行杂交，最后再借助荧光扫描等技术对杂交信号进行检测，以确定样品中特定微生物的存在情况[9]。

大部分食品营养较为丰富，同时具备碳源、氮源、生长因子等微生物生长需要的成分，适合多种微生物的生长繁殖，因此很多食品样品中微生物的种类较为繁杂、品种分布随机性强，而传统的增菌、培养、纯化鉴定等方法可能会导致部分低丰度以及不容易培养的微生物漏检，常规PCR多限于检测几种微生物的基因，无法全面分析食品受污染的具体状况，对于生产者改良工艺提升产品质量指导意义不强。而基因芯片具备的高通量、高度自动化等优点，可以为食品微生物种类研究、致病菌毒力研究、药敏基因检测等提供有力的数据支持[10-11]。此方法准确度高、可操作性强，但是成本相对较高，目前在食品微生物检测中应用尚不广泛[6]。但是随着分子生物学技术的不断发展和完善，基因芯片的制作成本日益下降，相信在不久的将来，应该也会得到大范围的应用。

2.4 RT-PCR检测技术在食品微生物检测中的应用

RT-PCR即逆转录PCR，是通过将RNA逆转录为cDNA，再通过常规的聚合酶链式扩增反应（PCR）实现在体外快速扩增cDNA的过程。该技术多用于检测食品中RNA病毒污染，例如新冠病毒等检测。疫情期间，三文鱼、樱桃等检测出新冠病毒，多采用该法进行。但是该法使用范围较窄，一般仅用于以RNA为遗传物质的病毒的检测中，其他微生物检测不适用于该法。

3 结语

由微生物（致病细菌、生物毒素、病毒等）造成的食源性危害严重时可危及生命，检测技术的进步使得人们能够及时发现，预防其对人类健康造成严重危害。目前基于PCR技术的食品微生物检测应用已经非常广泛，商业化程度较高，它一方面可以用于检测食品中的致病菌存在情况，从而有效防止食源性风险发生，另一方面也可以对食品中的菌相进行分析，对于食品发酵和食品工艺改进等方面也有重大意义。此外，在水生动物疫病检测、畜禽疫病检测、农作物种质资源鉴定、食品中转基因成分检测、食品中过敏源检测、物种鉴定、中药材及食品真伪鉴别等方面，PCR作为基础技术也被广泛应用。总之，无论是植物源食品还是动物源食品，只要是涉及基因检测，就一定会使用到PCR技术，PCR已经成为检测技术中最为常见的基础技术手段[12]。

目前，虽然PCR技术应用广泛，但是基于PCR的食品微生物检测技术对于复杂样品仍然存在背景干扰和假阳性等诸多问题，为了更好地防范由有害微生物污染带来的食品安全风险，进一步探索针对不同样品合适的PCR反应体系和反应条件，摸索开发出更灵敏、快捷、准确、通用的检测技术条件也迫在眉睫。此外，围绕PCR进行的很多化学试剂、酶、仪器等成本相对还是较高，随着分子生物学技术的发展和机械工业不断发展，试剂耗材仪器成本的降低，相信PCR技术的使用前景将更为广阔。

参考文献

[1]代娟.快速检测肠道致病菌的PCR技术的研究[D].成都：西华大学，2007.

[2]阮雁春.多重PCR检测技术在食品微生物检测中的应用价值分析[J].现代食品，2019（20）：127-128.

[3]楊平，杨迎伍，陈伟，等.食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究[J].西南大学学报（自然科学版），2007（5）：90-94.

[4]冯可，胡文忠，姜爱丽，等.鲜切果蔬中4种病原微生物多重PCR检测技术[J].食品科学，2018，39（6）：276-283.

[5]安利伟，陈蕊.多重PCR技术在检测食源性病原微生物中的应用[J].亚太传统医药，2010，6（8）：172-173.

[6]孙吉浩.PCR技术在食源性微生物检测中的应用与发展研究[J].生物化工，2016，2（2）：56-58.

[7]蔡军，李慧，欧竞堃，等.针对食品中的三类致病菌的多重PCR检测用引物组，试剂盒及检测方法：105463063B[P].2019-08-09.

[8]吴科明.多重PCR技术在致病菌检测中的应用进展[J].医药前沿，2018，8（11）：381-383.

[9]陈昱.基因芯片技术在食源性致病微生物检测中的应用研究[D].上海：上海海洋大学，2009.

[10]肖剑.分子生物学技术在食品微生物检测中的应用[J].广西轻工业，2011，27（3）：10-12.

[11]马新秀，胡文忠，冯可，等.多重PCR技术在鲜活农产品病原微生物检测中的应用[C]//2017中国食品科学技术学会第十四届年会暨第九届中美食品业高层论坛论文摘要集.北京：中国食品科学技术学会，2017：1.