植物激素和光暗培养条件对卷丹百合再生体系的影响

刘彦珍 郜新强 张元臣 陈思 郝静 吕有军

摘要：【目的】探究植物激素和光暗培養条件对卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb）再生体系的影响，为卷丹百合种质资源开发和大面积推广种植打下基础。【方法】以卷丹百合鳞片为外植体，分析培养基中不同植物激素[NAA、6-BA、2，4-D、噻苯隆（TDZ）和毒莠定（PIC）]配比及光（光照时间14 h/d）、暗（全天黑暗）培养条件对卷丹百合鳞片愈伤组织诱导、增殖及不定芽再生的影响，建立卷丹百合组培高效再生体系。【结果】与不添加任何激素的对照（CK）相比，添加激素的培养基均能显著提高卷丹百合鳞片愈伤组织的诱导率（P<0.05），其中TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L组合的效果最佳，暗培养条件下其愈伤组织诱导率达65.57%;在TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L的培养基中暗培养20 d后，再转入TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培养基中继续暗培养40 d，愈伤组织增殖倍数最高，可达2.45倍。6-BA与NAA组合比6-BA与PIC组合更利于诱导不定芽的产生，芽再生倍数最高的培养基为6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，暗培养条件下其再生倍数最高可达6.08倍。与光培养相比，暗培养更利于愈伤组织诱导和增殖，但在愈伤组织诱导不定芽阶段，长时间暗培养不利于芽的生长，暗培养20 d后转移至光培养条件下继续培养40 d，生成的不定芽色泽鲜绿，叶片伸展，长势旺盛，利于壮苗和生根。【结论】卷丹百合组织培养的不同阶段受不同种类和浓度的植物激素组合影响;暗培养条件更利于愈伤组织的诱导和增殖，暗培养结合光培养条件最适合不定芽的再生和分化。

关键词： 卷丹百合;植物激素;光暗条件;再生体系

中图分类号： S682.2                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1300-10

Abstract：【Objective】In order to lay a foundation for germplasm resources development and large area popularization of Lilium lancifolium Thunb， investigated the effects of plant hormones and light and dark culture conditions on the regeneration system of lily. 【Method】Using lily scales as explants， analyzing the effects on callus induction， proliferation and adventitious bud regeneration in lily scales affected by the ratio of different plant hormones[NAA， 6-BA， 2，4-D， thidiazuron（TDZ） and 4-amino-3，5，6-trichloropicolinic acid（PIC）] in the medium and light（illumination time：14 h/d） and dark（dark all day） culture conditions， to establish an efficient regeneration system for lily tissue culture. 【Result】Compared with the control that adding no hormones（CK）， mediea with different hormone combinations could significantly improve the callus induction rate of L. lancifolium（P<0.05）. The combination of TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L showed the best induction effectiveness， and the callus induction rate reached 65.57% under dark culture conditions. The scales of L. lancifolium was firstly cultured in TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L for 20 d in the dark ， and then cultured in TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L for 40 d in dark condition. In this case， the proliferation rate of callus was the highest， up to 2.45 times. The combination of 6-BA and NAA was more favorable to the induction of adventitious buds than the combination of 6-BA and PIC. The medium with the highest regeneration multiple was 6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L， and its regene-ration multiple was up to 6.08 times in dark condition. Compared with light culture， the dark culture was more conducive to callus induction and proliferation， but in the adventitious bud stage of the callus， the long-time dark culture was adverse to the growth of the bud. After incubating for 20 d in dark condition， the scales of L. lancifolium were transferred to the light condition and continue to cultivating for 40 d， the generated adventitious buds were bright green in colour， and its leaves were spreading and growing vigorously. Such adventitious buds were helpful to strong seedling and rooting. 【Conclusion】Different stages of tissue culture of L. lancifolium are affected by plant. Combination of different kinds and concentrations. Dark culture is more favorable to callus induction and proliferation， the combination of dark culture and light culture is the most suitable for the regeneration and differentiation of adventitious buds.

Key words： Lilium lancifolium Thunb; plant hormone; light and dark conditions; regeneration system

Foundation item： Henan Science and Technology Project（182102110209）; Anyang Science and Technology Project（2018-124）

0 引言

【研究意义】卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb）学名斑百合，为百合科百合属（Lilium spp.）多年生草本球根植物，具有较强的耐寒性和耐强日照性，种植适应性较广（洪波，2000;段祖安等，2009）。卷丹百合观赏价值高，食用价值和药用价值也极高，市场应用前景广阔，但由于其常规繁育方法繁殖周期较长，繁殖系数低（胥京宜，1999），制约了其产业的快速发展。因此，缩短卷丹百合繁殖周期，提高其繁殖系数，是当前卷丹百合产业化发展面临的主要问题，而建立卷丹百合的组培快繁技术体系是提高其繁殖效率和质量的有效途径，尤其是通过诱导外植体产生愈伤组织，进而由愈伤组织分化出无菌苗，可极大提高卷丹百合的繁殖效率，对其产业化发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，以百合鳞片为外植体诱导愈伤组织从而建立再生体系的研究较多。影响百合愈伤组织形成及再生体系建立的因素较多，包括百合种类的基因型、外植体生理状态、培养基类型及培养条件等。培养基中的植物激素种类及配比研究目前已有较多报道。邱岚等（2015）对梵净山野百合（L. brownii）鳞片进行愈伤组织和不定芽诱导，结果表明，最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。梁芳等（2017）以百合西伯利亚（Lilium×siberia）和索邦（Lilium×sorbonne）的鳞片为外植体，添加不同浓度的NAA、6-BA、噻苯隆（TDZ）、呋喃氨基嘌呤（KT）和吲哚丁酸（IBA），筛选出鳞片愈伤组织诱导、增殖、分化及再生苗生根的最佳培养基。张旭红等（2018）以欧洲百合（L. martagon）无菌苗鳞片为外植体，以MS为基本培养基，探讨了NAA、6-BA、TDZ和毒莠定（PIC）不同浓度组合对愈伤组织诱导、增殖及再生不定芽的影响，结果发现，诱导愈伤组织形成的最佳组合为0.2 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，促进愈伤组织增殖及不定芽再生的最佳激素组合为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。张文婷等（2019）以金黄花滇百合（L. bakerianum var. aureum）的鳞片为外植体，以MS为基本培养基，发现诱导愈伤组织形成的最适植物激素组合为1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，诱导不定芽增殖的最适植物激素组合为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。符勇耀等（2020）研究得出誘导卷丹愈伤组织形成的最佳材料为无菌小鳞片，愈伤组织最佳诱导培养基为MS+1.00 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.20 mg/L KT+0.05 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖，愈伤组织继代增殖最佳培养基为MS+1.00 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.20 mg/L KT+0.10 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖。柯义强等（2020）对兰州百合[L. davidii var. unicolor（Hoog） Cotton]新鲜鳞茎进行诱导，得出在MS培养基上，诱导愈伤组织形成和不定芽产生的最佳植物激素组合均为0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。李婷婷等（2020）研究发现，荞麦叶大百合（Cardiocrinum cathayanum）鳞片愈伤组织诱导的最适激素组合为1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，最利于愈伤组织分化不定芽的激素组合为2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。田山君等（2020）研究了不同激素配比对卷丹百合扩繁的影响，发现6-BA与NAA组合对诱导卷丹百合茎尖不定芽的产生和增殖效果明显。再生体系的建立除受植物激素种类及配比的影响外，还受到光暗因子的影响。任建宏等（2017）以平陆百合（L. brownie var. virridulum）的鳞片为外植体，研究光照和黑暗培养条件对其愈伤组织诱导效果的影响，结果发现光照培养更利于愈伤组织的诱导，诱导率超过57%，而黑暗培养诱导率仅为50%。张旭红等（2018）认为暗培养条件下欧洲百合鳞片愈伤组织的诱导率、增殖指数和芽再生系数均最高，分别可达77.14%、2.93和5.43，且愈伤组织生长状态较好，不定芽生根正常。王玉英等（2019）发现不同LED光源对百合组培苗小子球增殖效果存在显著影响。【本研究切入点】以卷丹百合无菌鳞片为外植体，诱导愈伤组织形成及增殖的研究目前虽有报道，但以愈伤组织为基础诱导不定芽产生的激素因子以及影响整个快繁体系的光暗因子的系统研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】以卷丹百合鳞片为外植体，以激素配比和光暗因子为主要切入点，探索愈伤组织诱导、增殖及不定芽再生的最适激素组合和光暗因子对各生长阶段的影响，建立组培高效再生体系，为卷丹百合种质资源开发和大面积推广种植打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2020年3—10月在河南安阳工学院生物与食品工程学院细胞工程试验室进行。卷丹百合鳞茎球直径8～10 cm，购自河南省安阳市宝莲寺镇盛蕊花木基地;植物激素NAA、6-BA和2，4-D购自北京康倍斯科技有限公司，TDZ和PIC购自郑州奥里吉生物科技有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体材料处理 剪去鳞茎球根系，去掉外层老化鳞片，用温洗衣粉水漂洗20 min，然后自来水冲洗30 min以上。在超净工作台上，将鳞茎球先用75%酒精溶液浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次，再用0.1%氯化汞溶液消毒10～12 min，无菌水冲洗3～5次，备用。

1. 2. 2 培养基及培养条件 以MS为基本培养基（生根培养为1/2MS），添加2.5%蔗糖和0.7%琼脂，调节pH 5.8～6.0。各培养基中添加的不同激素种类和浓度，在参阅资料的基础上确定浓度范围，然后通过预试验确定最终添加的浓度组合。培养温度23～25 ℃，环境湿度70%～80%，光培养时光照强度2000 lx，光照时间14 h/d;暗培养时全天黑暗（锡箔纸包裹）。

1. 2. 3 愈伤组织诱导 在超净工作台上，从无菌培养皿中用镊子将经过灭菌处理的鳞片剥离鳞茎球，将鳞片切成1 cm×1 cm大小的块状，接种于表1的培养基上，置于黑暗条件下对鳞片进行愈伤组织诱导，筛选诱导效果较好的培养基组合;使用黑暗条件下诱导效果较好的组合培养基对鳞片进行光培养诱导，并与暗培养条件下的诱导结果进行比较。每瓶培养基接种5块鳞片小块，每处理6次重复，50 d后统计诱导结果。

愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织的鳞片数/接种的鳞片总数×100

1. 2. 4 愈伤组织增殖 选择愈伤组织诱导率最高的2种培养基继续进行愈伤组织增殖培养，同时将该2种培养基重新设置植物激素的添加方式，以探求更利于愈伤组织增殖的培养基。将初代培养中诱导出的长势良好的愈伤组织分割成1 cm×1 cm小块，接种在增殖培养基上，分别在暗培养和光培养条件下进行增殖培养，60 d后统计愈伤组织增殖系数及鳞芽再生倍数。每瓶接种愈伤组织5块，每处理6次重复。

愈伤组织增殖系数=愈伤组织分割块数/接种的愈伤组织总块数

鳞芽再生倍数=产生的不定芽总数/接种的愈伤组织总块数

鳞芽诱导倍数=产生的不定芽总数/接种的鳞片总数

1. 2. 5 愈伤组织分化 将初代培養中增殖的愈伤组织接种于表2的培养基中，分别置于暗培养和光培养条件下进行愈伤组织分化。每瓶接种愈伤组织5块，每处理6次重复，60 d后统计各培养基不定芽再生情况，筛选最佳植物激素配比。对比不同光暗条件下不定芽发生的生理状态，确定促进不定芽再生的最适宜光暗条件。

1. 2. 6 生根诱导及炼苗移栽 将生长健壮的组培芽转接到生根培养基上，生根培养基配方为1/2MS+NAA 0.2 mg/L，光照培养60 d后观察其生根情况。将生根苗转移到温室内炼苗7 d，之后取出试管苗，清水洗去培养基，用0.1% KMnO4溶液浸泡10 s，种植于草炭基质中，于温室内种植管护，60 d后观察植株生长势并统计成活率。

1. 3 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0对试验数据进行处理和差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 不同激素配比和光暗培养条件对愈伤组织诱导的影响

2. 1. 1 不同激素配比暗培养条件下对愈伤组织诱导的影响 鳞片小块在不同培养基上暗培养50 d后，愈伤组织和鳞芽诱导结果见表3。不添加任何激素的对照处理（CK）没有愈伤组织形成，但可形成白色的鳞芽（图1-A），不同种类和浓度的激素配比对愈伤组织的形成存在明显影响。在TDZ与2，4-D组合的培养基中，A1（2，4-D浓度0.05 mg/L、TDZ浓度0.4 mg/L）处理的愈伤组织诱导率为61.38%，显著高于TDZ浓度为0.8 mg/L的A2处理（P<0.05，下同）;在相同TDZ浓度条件下（0.4或0.8 mg/L），2，4-D浓度为0.05 mg/L时的诱导率（61.38%和45.37%）分别显著高于2，4-D浓度为0.20 mg/L时的诱导率（32.88%和28.14%）。由此可看出，较低浓度的TDZ和2，4-D更利于愈伤组织的诱导。在TDZ与NAA组合的培养基中，诱导率最高的为A5处理（65.57%），其次为A7处理（58.64%），最低的是A8处理（41.66%）。表明低浓度的TDZ和NAA对卷丹百合愈伤组织的诱导更有利。

不同培养基对鳞芽的诱导中，CK有一定的诱导率（1.18），而在添加了一定浓度的2，4-D后，各培养基处理（A1～A4）鳞芽的诱导倍数均明显下降，且随着所添加2，4-D浓度的增加，诱导倍数相应降低，说明培养基中2，4-D的存在抑制了鳞芽的诱导，且浓度越高抑制作用越明显。而添加不同浓度的NAA（A5～A8处理）不但能增强对愈伤组织的诱导，而且对鳞芽的诱导也有明显的刺激作用。

由表3可看出，在卷丹百合鳞片愈伤组织诱导中，A1、A5和A7处理的愈伤组织诱导率虽然差异不显著（P>0.05，下同），但A5的愈伤诱导率最高，超过65.00%，因此，本试验中对卷丹百合鳞片愈伤组织诱导率最适宜的激素组合为TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L。从愈伤组织形成过程看，暗培养下形成的愈伤组织呈乳黄色，且以鳞片边沿伤口处为主要形成部位（图1-B）。

2. 1. 2 不同激素配比光培养条件下对愈伤组织诱导的影响 将2.1.1中愈伤组织诱导率超过50.00%的培养基（A1、A5、A6和A7）在光照条件下进行愈伤组织诱导，以CK为对照，结果见表4。不添加任何激素的CK无愈伤组织形成，但可形成嫩绿色的鳞芽，与暗培养条件下相比，相同时间光培养下形成的鳞芽较小，鳞片发育不充分（表4和图1-D），添加激素的培养基可刺激鳞片一端形成黄绿色的愈伤组织（图1-E）。在各培养基处理中，A5处理的愈伤组织诱导率最高，为21.36%，显著高于其他培养基处理;其次为A1（16.67%）和A7（15.48%）处理，二者间愈伤组织诱导率差异不显著。与暗培养相比，光培养条件下各处理的愈伤组织诱导率普遍较低;与暗培养条件相比，光培养条件下各处理鳞芽诱导倍数也明显降低。因此，黑暗条件更利于卷丹百合鳞片愈伤组织的形成。

2. 2 不同激素配比和光暗培养条件对愈伤组织增殖的影响

为探索卷丹百合愈伤组织增殖培养基，将表3和表4中对愈伤组织诱导率较高的2种培养基（A5和A1）的植物激素进行组合，编号为A9，即A9的植物激素组合为：TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L+NAA 0.2 mg/L。为研究2，4-D和NAA对愈伤组织增殖的阶段性影响，在含有TDZ和2，4-D的培養基中培养20 d后再转入含有TDZ和NAA的培养基中继续培养40 d，将该培养基编号为A10，即A10的植物激素组合为：（TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L）（初始20 d）+（TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L）（后续40 d）。将愈伤组织接种在A9、A10和A5培养基上分别进行光照和暗培养，60 d后愈伤组织增殖情况见表5。

从表5可看出，暗培养条件下，愈伤组织增殖效果最好的是A10处理，其增殖倍数为2.45，显著高于A5和A9处理，而A9与A5处理的愈伤组织增殖倍数差异不显著;光培养条件下，同种培养基处理的愈伤组织增殖倍数均低于暗培养条件，3种处理的愈伤组织增殖倍数差异性与暗培养条件下一致。对于芽再生倍数，在相同培养条件下3种处理的差异性及同种培养基不同培养条件下的差异性与愈伤组织增殖倍数的规律一致。说明无论愈伤组织增殖还是芽再生，A10处理的诱导效果均最好，且在暗培养条件下更利于愈伤组织和芽的增殖。因此，在诱导愈伤组织增殖过程中，较低浓度的2，4-D（0.05 mg/L）较短时间内（20 d）对愈伤组织的增殖诱导有良好的促进作用。培养基中2，4-D和NAA的添加方式不同，诱导率差异明显，调控二者对愈伤组织诱导的时间和顺序有利于提高增殖率。

另外，从愈伤组织的颜色和状态看，暗培养下形成的愈伤组织体积较大，结构致密，呈乳黄色（图1-C）;光培养下形成的愈伤组织体积较小，结构相对疏松，呈黄绿色（图1-F）。

2. 3 不同激素配比和光暗培养条件对愈伤组织再生不定芽的影响

2. 3. 1 不同激素配比和光暗培养条件对愈伤组织再生不定芽的诱导 由表6可知，无论光、暗培养条件，不添加任何激素的CK对愈伤组织再生的诱导倍数均显著低于其他培养基处理，说明培养基中不添加激素不利于芽的再生。暗培养条件下，在不同浓度的6-BA与NAA配比的培养基中，当NAA浓度为0.1 mg/L时，芽诱导率最高的培养基为B2，诱导倍数为6.08，其次为B3，诱导倍数为5.96，最低的是B1，诱导倍数仅为3.28，表明在NAA一定浓度下，较低浓度（0.2 mg/L）的6-BA不利于不定芽的诱导，但浓度过高（1.0 mg/L）对芽的诱导也有一定的抑制作用。将生长素NAA换成PIC，浓度保持0.1 mg/L不变，6-BA相同的浓度变化梯度，发现对不定芽的诱导情况与6-BA+NAA组合的诱导规律类似，诱导率最高的培养基组合为6-BA 0.6 mg/L+PIC 0.1 mg/L（B5），芽再生倍数为4.87，但显著低于培养基为6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L（B2）的芽再生倍数，说明对卷丹百合不定芽的诱导效果上，PIC远不如NAA。因此，对愈伤组织进行不定芽的诱导，选择适宜浓度的6-BA与NAA组合更利于芽的再生。

光培养条件下，统计不同浓度的6-BA与NAA组合及不同浓度的6-BA与PIC组合对芽再生情况的影响，发现二者对不定芽再生诱导的变化规律与在暗培养条件下对不定芽诱导的规律基本一致，芽再生倍数最高的培养基为B2处理，但该培养基在光照条件下的芽再生倍数明显低于黑暗条件下的芽再生倍数。

为探求光暗培养条件对愈伤组织再生不定芽的动态变化，对培养基B2处理在光、暗条件下不定芽发生数量分别进行统计，每隔10 d统计芽的再生倍数，至60 d止。由图2可知，接种后20 d，暗培养下不定芽的增殖速率明显高于光培养处理;20 d后光培养处理的不定芽增殖速率加快，与暗培养的增殖速率接近;50 d后，二者不定芽的增殖速率明显放缓，芽再生倍数趋于稳定。由图2可看出，在不定芽整个再生阶段，暗培养条件下不定芽的再生倍数始终高于光培养处理，且前60 d是促进不定芽增殖的关键时期。

2. 3. 2 光暗培养条件对不定芽生理状态的影响 对不定芽诱导最佳培养基（B2）处理产生的不定芽在光暗培养条件下的生理状态进行对比，结果（图3）显示，不定芽生理状态在光暗条件下差异明显。暗培养下（图3-A～图3-C），不定芽迅速增殖，芽排列紧凑，整个生长期均呈乳白色，20 d后每块愈伤组织增生的不定芽中有1～2个不定芽中间的生长点增长速度明显较快，至40 d时芽长度可达30 cm以上，可能是愈伤组织的增殖分化中心。其他部位的再生芽形成后生长速度较缓，至60 d时无论是鳞片叶还是生长点均在5 cm以下，部分鳞芽钝化不长或出现畸形，说明长时间的暗培养不宜于不定芽的继续生长发育。

光培养下（图3-D～图3-F），不定芽在整个生长发育过程均呈翠绿色，且20 d后愈伤组织增生的不定芽中有多处生长点凸起伸长，40 d后新生叶片生长加速并逐渐展开，至60 d时多个鳞芽的鳞叶长度在15 cm以上。光照条件有利于芽合成生长素促进芽的生长和叶片的发育，从而进一步促进形成的不定芽光合自养。但相对于暗培养，光照培养条件下不定芽增生的总体数量较少。将愈伤组织暗培养20 d后转到光培养条件下继续对不定芽进行增生诱导，光培养10 d后鳞芽明显转绿，边缘呈深绿色（图3-G）;培养20 d后多处鳞芽生长点及鳞片叶伸长并加速生长（图3-H）;至光照培养40 d时，每个鳞芽的大多数鳞片叶已伸长至10 cm以上，色泽鲜绿，且有部分鳞芽长出0.5 cm左右的根系（图3-I）。说明前期的暗培养诱导了较多的不定芽，转到光培养后，在光的诱导下基数较大的不定芽迅速生长，形成较多长势旺盛的不定芽。

综上可知，先黑暗条件下诱导培养20 d左右，然后转到光照条件下培养，不仅可促进卷丹百合鳞片愈伤组织上不定芽的增殖和发育，还可促使不定芽更健壮。

2. 4 生根诱导及炼苗培养

生根培养基培养不定芽60 d后，瓶苗长势旺盛，所有不定芽均已萌发新根（图4-A），最先萌发的新根长度超过5 cm，鳞茎超过2 cm（图4-B）。炼苗移栽后60 d，成活率为94.5%，大部分苗萌发6片以上新叶，叶色浓绿，长势旺盛（图4-C）。

3 讨论

建立卷丹百合离体再生体系进而高效繁育无菌组培苗对加快卷丹百合的商业化种植具有重要的现实意义。目前，百合的组培快繁多以鳞片为外植体，影响组培快繁效率的因子较多，包括外植体鳞片的取材部位（马怡迪，2015;方中明等，2016;祁宏英等，2018）、外植体消毒过程（柯义强等，2020;李婷婷等，2020）、基本培养基选择（方中明等，2016;马生军等，2018）、外源激素配比及浓度（段祖安等，2009;马怡迪，2015;张旭红等，2018;段四喜等，2019;张文婷等，2019）和培养条件等（Kedra and Bach，2005;Tang et al.，2010;任建宏等，2017;张旭红等，2018）。其中，不同种类及浓度的植物激素是影响百合组培快繁的关键因子（Bakhshaie et al.，2010;李莺等，2013），研究较多的激素因子中，生长素以NAA、IBA和2，4-D为主，分裂素以6-BA为主。

TDZ是一种人工合成的具有高效活性的生物調节剂，可促进外植体愈伤组织生长及提高形态发生能力，因此广泛应用于百合的组织培养（Lian et al.，2003;Mizuguchi et al.，2008;张旭红等，2018）。PIC是一种外源生长素类调控物质，对百合愈伤组织的胚性启动有良好的诱导及调控作用（Suzuki et al.，2001。张旭红等（2018）对欧洲百合鳞片进行愈伤组织诱导试验，发现诱导率最高的TDZ与NAA组合（TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L）优于诱导率最高的TDZ与PIC组合（TDZ 0.6 mg/L+PIC 0.01 mg/L）。2，4-D在初代培养阶段添加，可促进愈伤组织增殖和不定芽分化，但要求浓度范围较窄（Panizza et al.，1990）。本研究中，在卷丹百合愈伤组织诱导阶段，TDZ与NAA组合更有利，但在愈伤组织增殖阶段，在含TDZ的培养基中，2，4-D和NAA分别在不同时间段单独添加更有利于愈伤组织的增殖。

从愈伤组织高效诱导不定芽是百合组培繁育的关键环节。在植物激素的选择上，6-BA与NAA的组合对百合不定芽和小鳞茎的诱导效果较好，但二者最佳浓度配比，不同研究者间差异较大（Xu et al.，2009;Jin et al.，2014;Qi et al.，2014;张旭红等，2018;吕翠竹等，2020），可能与植物基因型、植株的生长发育状态或培养条件等因素有关。PIC在愈伤组织的诱导上应用较多（Mori et al.，2005;Khosravi et al.，2007;孙红梅等，2015;张旭红等，2018），但对增殖培养中不定芽的诱导是否有促进作用未见报道。本研究发现，6-BA与PIC组合对愈伤组织诱导不定芽有一定的促进作用，但芽再生倍数远低于6-BA与NAA组合对不定芽诱导的再生倍数，说明在不定芽诱导培养基中添加PIC不是最佳选择。

影响百合鳞片愈伤组织诱导、增殖及不定芽再生的各因素中，光暗培养条件至关重要。有研究认为光培养对百合愈伤组织的诱导系数及组培芽增殖系数高于暗培养（王杰等，2008;吕翠竹等，2020），但马怡迪（2015）认为暗培养有利于巨球百合胚性愈伤组织的生长。张旭红等（2018）研究发现，欧洲百合在光培养下形成的愈伤组织不但增殖缓慢，且极易褐化，而暗培养条件更利于愈伤组织的增殖及不定芽的再生。本研究结果也表明，卷丹百合鳞片愈伤组织的诱导、增殖及不定芽再生倍数，暗培养条件明显优于光培养，但为了促进新生鳞芽更好地生长和发育，在暗培养一定时间后（20 d）需及时转移到光培养条件才能更好地完成鳞芽叶片及根的生长发育。

4 结论

卷丹百合组织培养的不同阶段受不同种类和浓度的植物激素组合影响;暗培养条件更利于愈伤组织的诱导和增殖，暗培养结合光培养条件最适合不定芽的再生和分化。

参考文献：

段四喜，徐春莲，汤王外，和寿星. 2019. 2 种因素对兰州百合继代组培苗生长的影响[J]. 江西农业学报，31（7）：45-50. doi：10.19386/j.cnki.jxnyxb.2019.07.08. [Duan S X，Xu C L，Tang W W，He S X. 2019. Effects of two factors on growth of Lanzhou lily（Lilium brownii） with tissue subculture seedlings[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，31（7）：45-50.]

段祖安，王洪利，赵艳燕，王海朋，周启升. 2009. 卷丹百合组培快繁技术的研究[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），40（4）：495-497. doi：10.3969/j.issn.1000-2324.2009. 04.004. [Duan Z A，Wang H L，Zhao Y Y，Wang H P，Zhou Q S. 2009. Study on technology of tissue culture and rapid-propagation on Juandan lily[J]. Journal of Shandong Agricultural University（Natural Science），40（4）：495-497.]

符勇耀，秦密，陈驿，黄敏，徐文姬，雷美艳，杨利平. 2020. 一种卷丹愈伤组织的诱导与增殖方法[J/OL]. 分子植物育种，https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20201210. 1342.008.html. [Fu Y Y，Qin M，Chen Y，Huang M，Xu W J，Lei M Y，Yang L P. 2020. A method of callus induction and proliferation for Lilium lancifolium Thunb[J/OL]. Molecular Plant Breeding.]

方中明，于恒，白根祥，黄玮婷，曾宋君. 2016. 香水百合组织培养和快速繁殖条件的优化[J]. 江苏农业科学，44（8）：81-85. doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.08.022. [Fang Z M，Yu H，Bai G Y，Huang W T，Zeng S J. 2016. Optimization of tissue culture and rapid reproduction conditions of Lilium spp[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，44（8）：81-85.]

洪波. 2000. 百合花卉的研究综述[J]. 东北林业大学学报，28（2）：68-70. doi：10.13759/j.cnki.dlxb.2000.02.021. [Hong B. 2000. A summary of study on lilies[J]. Journal of Northeast Forestry University，28（2）：68-70.]

柯义强，郭鹏辉，马洪鑫，杨许花，高丹丹，刘湘君，马忠仁，丁功涛. 2020. 兰州百合组培快繁体系的构建[J]. 浙江农业学报，32（6）：1000-1008. doi：10.3969/j.issn.1004-1524. 2020.06.08. [Ke Y Q，Guo P H，Ma H X，Yang X H，Gao D D，Liu X J，Ma Z R，Ding G T. 2020. Rapid pro-pagation system establishment of Lanzhou lily[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，32（6）：1000-1008.]

李婷婷，李娜，李波，汪小飞，万志兵. 2020. 荞麦叶大百合组织培养初步研究[J]. 赤峰学院学报（自然科学版），36（9）：22-26. doi：10.13398/j.cnki.issn1673-260x.2020.09. 006. [Li T T，Li N，Li B，Wang X F，Wan Z B. 2020. Preliminary study on tissue culture of Cardiocrinum cathayanum[J]. Journal of Chifeng University （Natural Scien-ce Edition），36（9）：22-26.]

李鶯，李星，李生玲，徐薇. 2013. ‘黄天霸百合花器官愈伤组织诱导及植株再生[J]. 热带作物学报，34（8）：1507-1512. doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2013.08.018. [Li Y，Li X，Li S L，Xu W. 2013. Callus induction and plant regeneration from floral organ of Lilium‘Manissa[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，34（8）：1507-1512.]

梁芳，蒋素华，崔波，李霞. 2017. 两种东方系百合组织培养快繁技术[J]. 河南科学，35（2）：209-213. [Liang F，Jiang S H，Cui B，Li X. 2017.Tissue culture and rapid propagation of two Lilium Orential Hybird[J]. Henan Science，35（2）：209-213.]

吕翠竹，王有国，王立. 2020. 绿花百合组培芽增殖与试管鳞茎膨大的影响因素研究[J]. 西南林业大学学报，40（1）：38-45. doi：10.11929/j.swfu.201903131. [Lü C Z，Wang Y G，Wang L. 2020. Study on the Influencing factors of bud proliferation and bulblet swelling of Lilium fargesii in vitro[J]. Journal of Southwest Forestry University，40（1）：38-45.]

马生军，丁万红，李淑珍，靳元元，周晋. 2018. 百合鳞片组织培养研究[J]. 生物技术通讯，29（6）：819-824. doi：10.3969/ j.issn.1009-0002.2018.06.017. [Ma S J，Ding W H，Li S Z，Jin Y Y，Zhou J. 2018. Tissue culture for bulb scales of lilium brownie[J]. Letters in Biotechnology，29（6）：819-824.]

马怡迪. 2015. 野生百合高效再生体系建立及愈伤组织增殖调控研究[D]. 杭州：浙江大学. [Ma Y D. 2015. Studies on efficient regeneration system and regulation of callus proliferaion in wild lilies[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

祁宏英，徐洪国，杨伟丽. 2018. 用正交试验法优化香水百合试管鳞茎的诱导[J]. 江西农业学报，30（11）：32-34. doi：10.19386/j.cnki.jxnyxb.2018.11.08. [Qi H Y，Xu H G，Yang W L. 2018. Optimization of test-tube bulblet inducement of Lilium Oriental hybrid‘Casa Blancathrough orthogonal test[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（11）：32-34.]

邱岚，付素静，李艺. 2015. 梵净山野百合组织培养研究[J]. 种子，34（10）：39-43. doi：10.16590/j.cnki.1001-4705.2015. 10.039. [Qiu L，Fu S J，Li Y. 2015. Research on tissue culture of Lilium brownii from Fanjing mountain[J]. Seed，34（10）：39-43.]

任建宏，王鹏丽，殷丽娜，赵娟. 2017. 平陆百合愈伤组织诱导的正交试验研究[J]. 山西农业大学学报（自然科学版），37（3）：189-193. doi：10.3969/j.issn.1671-8151.2017.03. 008. [Ren J H，Wang P L，Yin L N，Zhao J. 2017. Callus induction of Lilium brownii var. viridulum by orthogonal test[J]. Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science），37（3） ：189-193.]

孙红梅，王锦霞，段鑫，张静，李雪艳，高鹤. 2015. 重瓣东方百合Double surprise离体快繁技术体系的建立[J]. 沈阳农业大学学报，46（4）：391-397. doi：10.3969/j.issn.1000-1700.2015.04.002. [Sun H M，Wang J X，Duan X，Zhang J，Li X Y，Gao H. 2015. Establishment of an in vitro rapid propagation system in oriental lily “Double surprise”[J]. Journal of Shenyang Agricultural University，46（4）：391-397.]

田山君，裴芸，牛力立，田洪梅，吴家丽，张万萍. 2020. 卷丹百合脱毒与快繁技术研究[J]. 种子，39（5）：157-162. doi：10.16590/j.cnki.1001-4705.2020.05.157. [Tian S J，Pei Y，Niu L L，Tian H M，Wu J L，Zhang W P. 2020. Study on virus-removal and rapid propagation technique of Lilium lancifolium Thunb[J]. Seeds，39（5）：157-162.]

王杰，刘国锋，包满珠，黄莉. 2008. 麝香百合胚性愈伤组织状态的调整与植株再生[J]. 园艺学报，35（12）：1795-1802. doi：10.3321/j.issn：0513-353X.2008.12.011. [Wang J，Liu G F，Bao M Z，Huang L. 2008. Adjustment of the status of embryogenic callus and plant regeneration of Lilium longiflorum[J]. Acta Horticulturae Sinica，35（12）：1795-1802.]

王玉英，白曉云，段正瑞，叶长宁，赵聃，李枝林. 2019. 不同LED光源对百合组培苗小子球繁育的影响[J]. 北方园艺，（24）：68-73. doi：10.11937/bfyy.20183407. [Wang Y Y，Bai X Y，Duan Z R，Ye C N，Zhao R，Li Z L. 2019. Effects of different LED light source on the breeding of small balls of lily tissue culture seedlings[J]. Northern Horticulture，（24）：68-73.]

胥京宜. 1999. 百合的开发与利用[J]. 湖北农业科学，（4）：44. doi：10.3969/j.issn.0439-8114.1999.04.019. [Xu J Y. 1999. Development and utilization of lily[J]. Hubei Agricultural Sciences，（4）：44.]

张文婷，何燕红，舒宁，邢景景，刘宝骏，包满珠，刘国锋. 2019. 金黄花滇百合植株再生与离体快繁技术体系的建立[J]. 植物学报，54（6）：773-778. doi：10.11983/CBB18256. [Zhang W T，He Y H，Shu N，Xing J J，Liu B J，Bao M Z，Liu G F. 2019. Plant regeneration and rapid propagation system of Lilium bakerianum var. aureum[J]. Bulletin of Botany，54（6）：773-778.]

张旭红，王頔，梁振旭，孙美玉，张金政，石雷. 2018. 欧洲百合愈伤组织诱导及植株再生体系的建立[J]. 植物学报，53（6）：840-847. doi：10.11983/CBB17208. [Zhang X H，Wang D，Liang Z X，Sun M Y，Zhang J Z，Shi L. 2018. Callus induction and establishment of a plant regeneration system with Lilium martagon[J]. Bulletin of Botany，53（6）：840-847.]

Bakhshaie M，Babalar M，Mirmasoumi M，Khalighi A. 2010. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Lilium ledebourii（Baker） Boiss，an endangered species[J]. Plant  Cell，Tissue and Organ Culture，102（2）：229-235. doi：10. 1007/s11240-010-9726-4.

Jin S M，Wang J，Wang X W，Sun D，Li G L，Genovesi A D，Liu S K. 2014. Direct and indirect shoot and bulblet regeneration from cultured leaf explants of Lilium pumilum，an endangered species[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，50（1）：69-75. doi：10.1007/s11627-013-9573-1.

K?dra M，Bach A. 2005. Morphogenesis of Lilium martagon L. explants in callus culture[J]. Acta Biologica Cracovien-sia Series Botanica，47（1）：65-73. doi：10.1016/j.jep.2004. 10.005.

Khosravi S，Azghandi A V，Mojtahedi N，Haddad R. 2007. In vitro propagation of Lilium longiflorum var. Ceb-Dazzle through direct somatic embryogenesis[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，10（15）：2517-2521. doi：10. 3923/pjbs.2007.2517.2521.

Lian M L，Chakrabarty D，Paek K Y. 2003. Growth of Lilium oriental hybrid ‘Casablanca bulblet using bioreactor culture[J]. Scientia Horticulturae，97（1）：41-48. doi：10.1016/ S0304-4238（02）00086-9.

Mizuguchi S，Ohkawa M，Ikekawa T. 2008. Effects of naphthaleneacetic acid and benzyladenine on growth of bulblets regenerated from white callus of mother scale of Lilium japonicum Thumb[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，63（2）：429-437. doi：10.2503/jjshs. 63.429.

Mori S，Adachi Y，Horimoto S，Suzuki S，Nakano M. 2005. Callus formation and plant regeneration in various Lilium species and cultivars[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，41（6）：783-788. doi：10.1079/IVP2005 707.

Panizza M，Tognoni F，Mansuali S A. 1990. Effects of va-rious factors on in vitro propagation of Lilium speciosum Thunb. and Lilium long iiflorum Thunb[J]. Advances in Horticultural Science，4（2） ：103-106.

Qi Y Y，Du L J，Quan Y H，Tian F F，Liu Y L，Wang Y J. 2014. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspension cultures and plant regeneration in Lilium tenuifolium Oriental×trumpet‘Robina[J]. Acta Physiol Plant，36：2047-2057. doi：10.1007/s11738-014-1582-0.

Suzuki S，Supaibulwatana K，Mi M，Nakano M. 2001. Production of transgenic plants of the Liliaceous ornamental plant Agapanthus praecox ssp. orientalis Leighton via Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic calli[J]. Plant Science，161（1）：89-97. doi：10.1016/S0168-9452（01）00393-4.

Tang Y P，Liu X Q，Gituru R W，Chen L Q. 2010. Callus induction and plant regeneration from in vitro cultured leaves，petioles and scales of Lilium leucanthum（Baker） Baker[J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment，24（4）：2071-2076. doi：10.2478/V10133-010-0077-4.

Xu L F，Ma F W，Dong L. 2009. Plant regeneration from in vitro cultured leaves of Lanzhou lily（Lilium davidii var. unicolor）[J]. Scientia Horticulturae，119（4）：458-461. doi：10.1016/j.scienta.2008.08.026.

（責任编辑 麻小燕）