广东黄心树种质表型与遗传多样性分析

丁释丰 高筱钰 吴林源 黄稚清 秦新生 冯志坚

摘要：【目的】研究廣东地区黄心树（Machilus gamblei）种质资源表型与遗传多样性，为黄心树种质资源的保护、利用及新品种选育提供基础数据。【方法】选择广东地区具有代表性的黄心树种群，从广州王子山森林公园、从化石门森林公园、惠州南昆山风景区等5个样地取样，测定黄心树表型性状指标与RAPD分子标记分析DNA片段多态性，探究黄心树种质资源表型与遗传多样性参数在群体间、群体内的分布与特征。【结果】测定的黄心树15个表型性状指标中，有12个性状指标的变异系数（CV）低于其平均值，11个性状指标的遗传多样性指数（H'）高于其平均值，表明其表型性状变异程度小，但变异类型丰富。高引物解析强度（Rp）引物OPAA-16、OPBH-10和OPB-17可有效评估黄心树样本间的遗传多样性。基于表型性状对30份黄心树样本进行聚类分析，以遗传距离10为阈值，广州王子山森林公园、从化石门森林公园与汕头南澳岛旅游区的样本的表征亲缘关系较接近。基于RAPD分子标记对30份黄心树样本进行聚类分析，在遗传距离为15时，可将所有样本分为5个类群，惠州南昆山风景区、从化石门森林公园与广州王子山森林公园的样本遗传距离较近，汕头市南澳岛旅游区与深圳马峦山郊野公园的样本也表现出相似的遗传背景。对比广东地区黄心树表型性状与RAPD分子标记的聚类分析，发现二者类群中样本情况一致性较差。【结论】广东地区黄心树种质的表型与遗传在种群间和种群内部变异都较为丰富，其中惠州南昆山风景区黄心树种群的表型与遗传多样性最为丰富，树种遗传改良、资源开发利用等相关工作可于此处开展。

关键词： 黄心树;种质资源;表型多样性;遗传多样性;广东

中图分类号： S792.24                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1291-09

Abstract：【Objective】To study the phenotype and genetic diversity of Machilus gamblei King ex Hook. f. germplasm in Guangdong and provide the basic data for conservation， effective utilization of M. gamblei gemplasm and the breeding of new varieties. 【Method】Five typical populations of M. gamblei in Guangdongwere selected， such as Guangzhou Wangzishan Forest Park， Conghua Shimen National Forest Park， Huizhou Nankunshan Resort and so on. Phenotypic traits were determined and RAPD markerswere used in this study to analyze DNA fragment diversity， to explore the distribution and characteristics of phenotypicand genetic diversity between the populations and inside the populations. 【Result】Among the 15 phenotypic traits of M. gamblei， the coefficient variation（CV） of 12 phenotypic traits were lower than its average; and the genetic diversity index（H'） of 11 traits were higher than the average. The result showed that M. gamblei variation degree of phenotypic traits was low， but the variation types were abundant. The high resolving power（Rp） primers， OPAA-16， OPBH-10 and OPB-17， could effectively evaluate the genetic diversity among different samples of M. gambleiin Guangdong. Based on phenotypic traits， 30 samples of M. gamblei were clustered when genetic distance was 10， and the characterization relationship of samples which from Guangzhou Wangzishan Forest Park， Conghua Shimen Forest Park and Shantou Nanao Island Resorts was close. At the genetic distance of 15， based on the RAPD markers， 30 samples could be divided into 5 groups， samples of Huizhou Nankunshan Resorts， Shimen Forest Park and Wangzishan Forest Park had close genetic distance， samples of Nanao Island Resorts and Shenzhen Maluanshan Country Park showed similar genetic background. By comparing the cluster of phenotypic traits and RAPD markers， poor consistency of samples in the two groups was found. 【Conclusion】The phenotypic traits and genetic diversity of M. gamblei in Guangdong has rich variation between the populations and inside the populations. Samples from Huizhou Nankunshan Resort show the richest variation in both phenotypic traits and genetic diversity， which would be helpful for germplasm resources species improvement， effective utilization and other related researches.

Key words： Machilus gamblei King ex Hook. f.; germplasm resource; phenotypic diversity; genetic diversity; Guangdong

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31870699）; Forestry Science and Technology Innovation Project of Guangdong（2014KJCX005-02，2017KJCX024）

0 引言

【研究意义】种质资源的遗传多样性是改良植物遗传特性及培育新品种的重要基础。黄心树（Machilus gamblei King ex Hook. f.）系樟科（Lauraceae）润楠属（Machilus）常绿乔木，分布于我国华南和西南地区，在印度、尼泊尔及越南北部也有分布。黄心树树姿优美，花芽和新叶多彩艳丽，枝叶浓密青翠呈层状伸展，材质优良且适应性强，在园林、建筑、医学和香料等领域具有重要的生态和经济价值，是开发前景较为广阔的树种（李阳等，2014;Chetia et al.，2017）。近年来，人类的过度砍伐与开发，黄心树的生境不断遭受破坏，加之植物大小年花果情况差异大、自身结实能力较低及自然更新能力不高等自身原因，黄心树等润楠属植物生存境况令人堪忧（黄秋生等，2014）。广东地区是黄心树的主要产地之一，对该区域内黄心树种质资源表型与遗传多样性进行研究，有利于黄心树种质资源鉴定，为种质资源保存提供遗传背景和实验依据，对黄心树种质资源进一步开发和地方特色品种选育工作有着重要的指导意义。【前人研究进展】作为饲养琥珀蚕（Antheraea assama Ww.）的经济性作物（Chetia et al.，2017），国外对于黄心树的相关研究开展较早，但大多集中于种植栽培方面。Das等（2010）、Chattopadhyay等（2014）、Boruah（2020）针对黄心树炭疽病、灰枯病等病虫害的发病原理进行了相应的研究。Devi等（2014）通过元素示踪技术证实了黄心树对于PM2.5及重金属等有害物质有吸收和富集作用，能够有效净化环境。Gogoi等（2009）对4个黄心树同源四倍体及其二倍体亲本的质量性状和数量性状进行研究，证实了四倍体性状更具稳定性，并提出有必要结合分子技术分析黄心树的不同形态性状。Rahman等（2012）应用RAPD分子标记对印度Assam Goalpara地区的黄心树种质资源遗传多样性进行了研究，结果表明其遗传多样性较为丰富。Kumar（2016）针对黄心树表型特征的研究，推测其表型特征的多样性可能主要受气候条件的影响。【本研究切入点】目前，国内对于黄心树的研究较少且局限于栽培、用途及生态效益等方面（杨泽雄等，2016;冯力等，2020），在种质的收集、识别以及评估的相关研究还处于空白状态。【拟解决的关键问题】以广东地区黄心树种群为试验材料，通过测定其表型与遗传多样性分析遗传结构的差异，探究黄心树遗传多样性参数在群体间及群体内的分布与特征，为树种遗传改良、种质资源保护及资源深度开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

在实地调查及2年物候观测的基础上，于2018年9月—2019年3月从广东省广州王子山森林公园、从化石门森林公园、惠州南昆山风景区、深圳马峦山郊野公园及汕头南澳岛旅游区黄心树种群内进行取样，选择生长发育正常、无严重缺陷和无明显病虫害的植株（表1）。为保证取样的均匀性，样株间水平距离50 m以上，海拔相差5 m以上，随机摘取样株树冠中部当年生枝5～10个和顶端轮生叶10～15片，用于表型性状测定;于次年展叶期（2—3月），于同一样株择取健康幼叶若干，用密封袋贮藏，加入变色硅胶干燥，置于4 ℃低温冷藏，用于种质遗传多样性分析。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 表型多样性测定 选取黄心树叶部表型性状作为探讨其亲缘关系的性状子集，共选择15个表型性状特征进行分析（表2）。黄心树表型性状可分为质量性状和数量性状，为准确、客观地用数码差别来反映质量性状间的差异程度，同一质量性状有多种状态者采用有序多态编码，同一特征各状态间差别基本一致者，采用顺序序列间隔相等的编码数值;数量形状为可直接测量的量，经扫描仪扫描后，应用Digimizer application 4.6.0测定。

1. 2. 2 遗传多样性测定 （1）DNA提取。选用上海生工生物有限公司Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒进行样本DNA提取，试验操作参考说明书进行。黄心树叶片组织存在高浓度的酚类物质，为去除植物组织中的多酚与多糖，按照操作说明书加入三氯甲烷之后，每管用等体积酚·三氯甲烷（pH 8.0）反复混匀，于12000 r/min离心5 min，取上层清液，反复抽提3次，再按照说明书进行下一步操作。（2）RAPD引物筛选。随机选取5个黄心树样本对Operon公司OPA、OPB、OPC、OPO、OPAA及OPBH组别的60个10碱基RAPD随机引物进行筛选（Rahman et al.，2012），引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成。（3）PCR反应体系与扩增程序。PCR反应过程中退火温度和退火时间对于扩增结果的影响较大（焦锋和楼程富，2000），为使试验结果更准确，在正式试验前设置不同的退火温度和退火时间，进行预实验，以確定最佳扩增条件。通过相关预试验，最终决定PCR扩增反应在20 μL体系中进行（10 μL 2×Taq Plus Master Mix，1.60 μL引物，1 μL样本DNA，7.4 μL ddH2O）。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环，72 ℃延伸6 min。（4）电泳条件：采用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，电压70 V，电泳时间150 min。

1. 3 统计分析

1. 3. 1 表型多样性数据分析 表型指标数据用IBM SPSS Statistics 22.0进行处理，将对原始数据矩阵进行Z分数标准化处理，并用标准化后的矩阵求变异系数（Coefficient of variation，CV），利用Shannon-Weaver遗传多样性指数（Genetic diversity index，H'）来衡量性状遗传多样性大小（刘志斋等，2008;李华锋等，2016）。

1. 3. 2 遗传多样性数据分析 综合每条引物电泳的条带信息（Bands information，iB），计算每条引物的条带多态率（Percentage of polymorphic bands，PPB）與引物解析强度（Resolving power，Rp）。依据PCR扩增产物电泳后的条带，采取1/2赋值记带，将在琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为1，未出现DNA片段的记为2;所得数据运行IBM SPSS Statistics 22.0进行分析，采用Jaccard法进行聚类分析，计算遗传相似系数（Genetic similarity coefficient，GS）及遗传距离。

2 结果与分析

2. 1 黄心树种质表型多样性分析

2. 1. 1 变异系数与遗传多样性指数分析 广东地区黄心树种质资源15个表型性状的CV值为28.33%，其中幼枝毛被情况和冬芽芽鳞毛被情况的CV值最小，均为0%;叶尖偏向的CV值最大，其次是幼枝皮孔数量和叶面积指数，分别为118.42%、93.04%和29.59%。表型性状的H'为1.1764，其中叶片长度的H'最大，为1.6029;叶尖长度、叶长/叶尖、左叶基角和叶基角比（左/右）的H'也均超过1.5000;幼枝毛被情况和冬芽芽鳞毛被情况的H'最小，均为0（表3）。

2. 1. 2 基于表型性状的聚类分析 将黄心树15个表型性状数据经标准化处理后，对30份样本进行聚类分析。以遗传距离15为阈值，样本被分为3个类群，分别包含14、5和11份样本。如图1所示，以遗传距离10为阈值，可将所有样本分为5个类群，类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别包含9、5、5、4和7份样本。类群具体特点：类群Ⅰ中以从化石门森林公园和汕头南澳岛旅游区的样本为主;深圳马峦山郊野公园样本多集中于类群Ⅲ中;类群Ⅴ中以广州王子山森林公园和汕头南澳岛旅游区的样本为主。此外，所有类群中均有惠州南昆山风景区的样本，而其他样地的样本分别只在3个类群中有所分布。

2. 2 引物扩增产物分析

2. 2. 1 引物筛选结果 有研究表明，当不同样本间表型形态差异较大时，种类较少的引物就能够评估不同个体之间的遗传多样性（Clegg et al.，2002）。选取WZS-1、SM-1、NKS-1、MLS-1和NAD-1等5个样本对OPA、OPB、OPC、OPO和OPAA及OPBH组别的60个RAPD随机引物进行筛选，根据扩增条带的清晰度、稳定性及多态性共筛选出10条RAPD引物（表4）。

2. 2. 2 引物条带分析 广东地区黄心树种质资源在表型性状上表现出一定的差异性，通过RAPD分子标记揭示其种质遗传物质的多态性水平也较高。用10条RAPD引物对30份样本进行PCR扩增，共计扩增出51个条带，大小为100～2500 bp，平均每条引物可扩增出5.1个条带，PPB为50.00%～85.71%（表5）。其中，多态性条带共扩增出34个，占总条带数的66.67%，平均每条引物扩增出3.4个多态性条带，平均多态性比率达64.81%。Rp是衡量引物品种辨别能力和引物效率的重要指标，本研究中使用的单一引物不能够区分所有的样本DNA的多样性，但高Rp的有效引物（OPAA-16、OPBH-10和OPB-17）可用于评估不同样本间的遗传多样性（图2）。

2. 3 黄心树种质遗传多样性分析

2. 3. 1 遗传相似系数分析 基于RAPD分子标记的图谱矩阵结果计算30份黄心树样本，结果显示遗传相似系数为0.36～0.96，平均值为0.75。遗传相似系数矩阵热图（图3）显示了群体间NAD-6与MLS-3、NAD-5与NKS-3及WZS-5与NKS-1的遗传相似系数最大，均为0.96，表明这些样本的遗传背景相似，亲缘关系较近;NKS-5与MLS-4、MLS-6的GS值最小，分别为0.38和0.37，表明其亲缘关系最远。此外，矩阵热图还显示惠州南昆山风景区的黄心树样本的遗传相似系数平均值最低，仅0.69，表明在所有样地中惠州南昆山风景区的黄心树种群遗传多样性程度最高;广州王子山森林公园的黄心树样本的遗传相似系数平均值最高，其次为汕头南澳岛旅游区，群体遗传相似系数平均值分别为0.86和0.84，表明其群体内遗传多样性程度较低。

2. 3. 2 基于RAPD分子标记的聚类分析 基于RAPD分子标记的PCR扩增结果，对广东地区30份黄心树样本进行聚类分析（图4）。在遗传距离为20时，可将所有样本分为3个类群，分别为包含12份样本和16份样本的2个主类群，以及包含2份样本的次类群。在遗传距离为15时，可将所有样本分为5个类群，类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别包含4、8、10、6和2份样本;类群具体特点：类群Ⅰ以惠州南昆山风景区、广州王子山森林公园的样本为主，类群Ⅱ主要包含从化石门森林公园、广州王子山森林公园的样本，类群Ⅲ的样本以汕头市南澳岛旅游区、深圳马峦山郊野公园为主。将上述结果与广东地区黄心树表型性状聚类结果对比，发现二者类群中样本情况不完全一致，推测其表型多样性与遗传多样性发生机制不同。

3 讨论

对广东地区30份黄心树种质样本的15个表型性状的CV和H'进行分析，结果表明30份样本表型性状CV与H'一致性较低。CV反映了性状差异的离散程度，其大小反映的是性状变异范围大小（王海平等，2014）;H'是反映种质资源间多样性的另一个重要指标，其大小反映了性状多样性的丰富程度（赵香娜等，2008），因此，CV和H'间不存在相关关系。植物种群的空间结构特征意味着植物必须适应不同的环境条件，并因生境的差异产生种群的生态分化，而植物营固生长的习性决定了植物在环境中的表型性状特征具有很大的可塑性（胡启鹏等，2008）。本研究发现，黄心树15个表型性状指标中，有12个性状指标的CV低于其平均值，11个性状指标的H'高于其平均值;证明广东地区黄心树表型性状变异程度小，但变异类型丰富，这一特性有利于黄心树的资源配置。

本研究使用10条RAPD引物有效评估了广东地区黄心树种质样本的遗传多样性，其中高Rp的引物OPAA-16、OPBH-10和OPB-17可用于评估黄心树不同样本间的基因遗传多样性。基于RAPD分子标记所揭示广东地区黄心树种质遗传多样性程度较高，但相较于RAPD分子标记对浙江润楠、黑壳楠、舟山新木姜子及香樟等其他樟科树种种质遗传多样性的研究而言（宋爱云等，2003;Wang et al.，2005;张守锋，2012;骆嘉言等，2017），广东地区黄心树种质的遗传变异程度并不算高。基于RAPD分子标记的遗传相似矩阵表明，惠州南昆山风景区黄心树种群表型及遗传多样性最为丰富，可为种质资源的综合利用、开发提供原材料，树种遗传改良、资源开发利用等相关工作可于此处开展。

聚类分析发现，广东地区黄心树样本的表型与遗传在群落间和群落内均存在一定的多样性。植物表型性状特征的体现是生境条件与遗传物质共同作用的产物，研究发现生境条件类似的黄心树种群在表型与遗传多样性上相似性程度较高。广州王子山森林公园、从化石门森林公园与惠州南昆山风景区的黄心树样本在表型与遗传上的变异较其他样地的样本都更为接近，这3个样地间的地理距离较为接近，并有着相似的气候条件，结合润楠属植物在我国的地理分布（胡晓敏等，2011;胡文强等，2017），推断上述3个样地的黄心树种群亲缘关系最为接近，之前或属于同一种群，造成如今片状分布的结果可能是由于人类活动导致的限制因子或生态障碍所致。同时也发现，深圳马峦山郊野公园与汕头南澳岛旅游区的黄心树样本的亲缘关系也较为接近。现有的研究成果已经肯定了不同生态小环境可导致不同群体遗传结构的显著差异（Taylor and Aarssen，1990;Gehring and Linhart，1992）。若同种植物的生活史相同，且生活史格局具有同一性，那么小生境差异形成的自然选择作用将进一步引起种群间的歧化过程。汕头南澳岛旅游区和深圳马峦山郊野公园均具有海、陆属性动态而复杂的自然环境，面临着空气、土壤中的盐分及台风气候等对植物造成的伤害（侯梦莹等，2019），这些遗传上的变异虽然不一定表现在表型性状特征上，但一定程度上可推断黄心树生态适应的方向和途径与其环境综合作用中的主导因子密切相关。

此外，聚类分析发现同一样地的黄心树样本并未形成单一类群，可能与其分布范围广、分布区内环境因素多样有关。地理隔离导致基因流动的隔离是导致群体间遗传分化的因子之一，但地理隔离在种群分化过程中的相对贡献尚不明确（He et al.，2016;Zhang et al.，2016）。地理距离与群体间遗传分化程度有所关联，但造成特定的遗传差异需结合各项生长因子（叶俊伟等，2017），因此不能完全以地理距离划分物种的遗传变异方向异同（杨晓霞等，2016）。

4 结论

基于黄心树表型性状测定与RAPD分子标记技术所揭示的广东地区黄心树种质在群落间和群落内的表型与遗传多样性程度较高。其中，惠州南昆山风景区黄心树种群表型与遗传多样性最为丰富，可为种质资源的综合利用、开发提供原材料，树种遗传改良、资源开发利用等相关工作可于此处开展。

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（責任编辑 邓慧灵）