海水环境下砂浆表面生物被膜特性及其对砂浆性能影响

荣 辉, 瞿 威, 马国伟, 王海良, 张津瑞

(1.天津城建大学 材料科学与工程学院, 天津 300384; 2.天津城建大学 天津市建筑绿色功能材料重点实验室, 天津 300384; 3.河北工业大学 土木与交通工程学院, 天津 300401; 4.天津城建大学 土木工程学院, 天津 300384; 5.天津大学 水利工程仿真与安全国家重点实验室, 天津 300072)

在污水和废水处理系统中,微生物会对混凝土造成腐蚀,使混凝土耐久性逐渐退化,这不仅会导致每年数十亿美元的经济损失,而且会影响系统的整体使用安全,因此微生物对混凝土的腐蚀研究迫在眉睫[1-2].微生物的细胞黏附、生长状况和生物被膜的形成等特性可能是微生物对混凝土造成腐蚀的关键因素[3-4].

污水、淡水、海洋、石油等环境介质中,微生物首先在物理、化学、生物共同作用影响下,通过范德华力、疏水力以及静电作用使其附着在砂浆表面.接着,附着在砂浆表面的微生物通过分泌胞外聚合物(EPS)形成生物被膜[5-7],进而对砂浆性能造成影响.生物被膜的成长和群落组成会受到温度、pH值、光照、水动力、养分和有机质等环境因素的制约,因此有学者对不同环境因素下砂浆表面形成的生物被膜中微生物群落和分布特征进行了研究,结果发现生物被膜的附着会影响介质的传输,进而对混凝土性能造成影响[8-12].

目前生物被膜对砂浆性能的研究主要集中在污水环境,而海水环境中砂浆表面的生物被膜对砂浆的性能影响规律是什么？生物被膜在砂浆表面到底起腐蚀作用还是保护作用？想要了解海水环境中砂浆表面形成的生物被膜对砂浆性能的影响,则需首先探明海水环境中砂浆表面形成的生物被膜基本特性,然后再研究砂浆表面形成的生物被膜对砂浆性能的影响.研究表明,海洋中存在着大量的硫氧化细菌[13-14].因此,本文拟通过配置含有硫氧化细菌的人工海水进行研究,试验首先通过研究海水环境中砂浆表面生物被膜的官能团、成分构成、厚度演变和生物被膜形貌等,阐明海水环境下砂浆表面形成的生物被膜基本特性,然后通过分析不同龄期砂浆的表观形貌和抗压强度,同时结合X射线衍射(XRD)和热重分析(TG-DTG)研究试样的水化产物,进而研究确定海水环境下砂浆表面生物被膜对砂浆性能的影响.

1 试验

1.1 试验材料

水泥采用P·O 42.5普通硅酸盐水泥,购自顺鑫水泥有限公司;砂采用天然河砂,细度模数为2.8;减水剂采用萘系高效减水剂,减水率(质量分数)为25%.

微生物采用硫氧化细菌,按2%(体积分数)接种到人工海水培养基中,每12d更换1次人工海水培养基.人工海水培养基成分见表1.

表1 人工海水培养基成分

1.2 试验方案

砂浆设计强度为M50,配合比m(水)∶m(水泥)∶m(砂子)∶m(外加剂)=0.33∶1.00∶1.50∶0.01.试样尺寸为40mm×40mm×160mm,标准养护28d后进行试验.本试验设置试验组(SB)和对照组(DB),其中试验组为灭菌后的人工海水培养基+硫氧化细菌+试样,对照组为灭菌后的人工海水培养基+试样,每组试样均半浸在培养基中,如图1(a) 所示.为方便后期观察,将试样气液交界面处(生物被膜附着部位)标记为A区域,图1(b)为附着生物被膜的试样在海水中浸泡时所处状态示意图.龄期分别设置为7、15、30、45、60、75、90、120d.

图1 试验装置Fig.1 Experimental apparatus

1.3 试验方法

1.3.1生物被膜成分验证

采用Bruker生产的Tensor27型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)对砂浆表面形成的生物被膜官能团进行分析.为进一步验证生物被膜成分,在龄期30d时,分别在4只试管内将生物被膜提取液进行梯度稀释,使其体积分数依次为20%(1#)、40%(2#)、60%(3#)、80%(4#),然后分别采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法和结晶紫染色法对生物被膜的成分作进一步验证.

1.3.2生物被膜厚度演变与形貌

将经过体积分数0.1%结晶紫染色过的生物被膜烘干,采用VHX-600E型超景深显微镜沿着生物被膜平行测量,每1.6cm为1个步长,取平均数作为该龄期的生物被膜厚度.另外,分别取试验组和对照组A区域的一部分试样固定在体积分数为2.5%的戊二醛溶液中,在4℃冷藏室放置2h后,用0.2mol/L 的磷酸缓冲液漂洗3次,最后用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水,每次15min.脱水后放入30℃烘箱干燥,将烘干的试样取出,在样品台上喷金镀膜,采用JSM-7800F型场发射扫描电子显微镜(SEM)和能谱仪(EDS)分析生物被膜形貌和元素组成.

1.3.3砂浆宏观形貌与性能

使用普通摄像机记录砂浆表面形貌在不同龄期的变化,同时按照GB/T 17671—1999《水泥胶砂强度检验方法(ISO法)》进行抗压强度试验,并计算浸泡后试样的抗压强度增长率R：

R=(f2-f1)/f1×100%

(1)

式中：f1为试样在龄期7d时的抗压强度,MPa;f2为试样分别在龄期15、30、45、60、75、90、120d时对应的抗压强度,MPa.

1.3.4微观分析

将每组试样A区域(见图1(b))使用去离子水和无水乙醇冲洗3遍,尽可能将表面杂质清除干净.试样在50℃ 烘箱中干燥12h后,使用研钵研磨成粉末,至全部通过10μm方孔筛,继续放入50℃烘箱中干燥6h.采用RD/MAX-Ultima Ⅳ型X射线衍射仪分析物相组成,扫描步长为0.02°,扫描速度为8(°)/min,扫描范围为10°～60°.采用Q600型同步热分析仪分析砂浆矿化产物的含量,由室内温度25℃开始加热,直至升温到800℃,测试时采用N2保护气氛,升温速率为20℃/min.

2 结果与讨论

2.1 生物被膜官能团与成分构成

2.1.1生物被膜官能团

龄期到达30d时,试验组试样在气液交界面处附着的黄色黏稠物质大量增多,如图2所示.取黄色物质进行FTIR测试,结果见图3.

图2 砂浆表面黄色黏稠物质Fig.2 Yellow viscous substance on mortar surface

图3 黄色黏稠物质的FTIR图谱Fig.3 FTIR spectrum of yellow viscous substance

2.1.2生物被膜成分构成

多糖和蛋白质的存在可以有效证明砂浆表面形成的黄色黏稠物质为生物被膜[4],这是因为多糖和蛋白质是胞外聚合物EPS的主要成分,两者含量一般占EPS总量的75%～80%.30d时生物被膜成分验证结果见图4.

图4 30d时生物被膜成分验证结果Fig.4 Biofilm composition validation results(30d)

由图4(a)可以看出,1#试管内颜色相对较淡,随着后续试管中提取液的体积分数不断增大,试管内提取液的反应颜色依次加深.这是因为苯酚与多糖脱水后的糠醛衍生物会形成有色络合物,可将溶液变为橙黄色[15],此现象证明黄色黏稠物质中含有多糖.由图4(b)可以看出,1#试管内蓝色程度还不是很明显,随着后续试管中提取液体积分数不断增大,试管内提取液的反应颜色也依次加深.这是因为考马斯亮蓝染料与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸的残基通过疏水力相结合,会将溶液变为蓝色[16],此现象再次证明了黄色黏稠物质中含有蛋白质.

图4(c)是结晶紫染色生物被膜的照片.由图4(c) 可以看到,结晶紫染色后的试验组A区域显蓝色,而对照组相同位置处并没有发生显色反应,仍呈黑色.这是因为活细胞可以摄入溶解后的结晶紫,从而使细胞中的DNA、蛋白质和脂肪着色.这也证明了砂浆表面形成的黄色黏稠物质是生物被膜,而对照组表面此时还没有形成一定规模的生物被膜.

结合图3、4,可以证明30d时海水环境下硫氧化细菌在砂浆表面形成的这种黄色黏稠物质是生物被膜,该生物被膜由多糖、蛋白质和微生物构成.

2.2 生物被膜厚度演变及形貌

2.2.1生物被膜厚度演变

由于试验组在15d时开始附着少量的生物被膜,故从15d开始采用超景深显微镜测量各龄期生物被膜厚度,结果见图5.

图5 各龄期生物被膜厚度Fig.5 Biofilm thickness at different ages

由图5可见：试验组的生物被膜在15d时厚度为0.16mm,15～30d增长速度最快,期间增加0.63mm,这是因为,附着的硫氧化细菌开始分泌大量EPS,生物被膜在砂浆表面快速繁殖,不断叠加生长,使得生物被膜厚度快速增加;在75d时,生物被膜厚度达到了最高值1.70mm,此时生物被膜已经趋于成熟;75～90d内,生物被膜厚度开始下降;90d 后其厚度缓慢增加,120d时其厚度增至1.59mm.这是因为,海水环境中的营养物质难以维持更多生物被膜的繁殖,部分营养物质难以到达生物被膜深处,致使生物被膜增长速度逐渐减缓,表面黏附力逐渐减弱,部分生物被膜开始脱落.90d之后海水中的营养物质和氧气再次满足大部分硫氧化细菌的繁殖需求,新的生物被膜重新开始繁殖并附着,从而使生物被膜厚度呈现出先下降后缓慢增加的现象.

另外,通过对比可发现,对照组生物被膜厚度远小于试验组,在120d时,对照组生物被膜厚度仅为0.45mm,原因是对照组在后期会形成杂菌[17],从而导致对照组中也形成了微量的生物被膜.

2.2.2生物被膜形貌

图6为30d时海水环境下砂浆表面生物被膜微观形貌.由图6可见,生物被膜是具有三维立体结构的细菌群落,内部结构错综复杂,细菌固着在胞外聚合物内,细菌多呈卵状和气泡状,胞外聚合物作为基质彼此相互黏附.

图6 30d时海水环境下砂浆表面生物被膜微观形貌Fig.6 Micromorphology of biofilm on mortar surface in seawater environment(30d)

图7是2组试样A区域的EDS分析.由图7(a)可以看出：试验组表面的主要元素为O、C、Na、P；O元素含量最高,为68.92%,其次是C元素,含量为22.31%,这是因为试验组表面附着生物被膜,而生物被膜中多糖和蛋白质的主要元素均为C、O;另外,出现了含量为5.93%的P元素,而P为脂类特有的元素[18].图7(b)显示对照组表面主要元素依次为O、Si、Ca.结合图2、6可知,30d时试验组表面已经出现大量生物被膜,厚度为0.79mm,而30d时对照组的生物被膜厚度仅为0.24mm,表明对照组表面的生物被膜附着范围非常有限,且附着的量也极少,因此30d时很难在对照组表面精准测出生物被膜内的C、P元素含量.

图7 2组试样A区域的EDS分析Fig.7 EDS analysis of A region of two groups of samples

2.3 砂浆宏观形貌与性能

2.3.1砂浆宏观形貌

为了比较有无生物被膜对试样表面形貌的影响,选取7、15、120d龄期时试样的宏观形貌进行对比,如表2所示.由表2可见：试验组在7d时气液交界面下方初步变黑,15d时颜色进一步加深,原因是15d时初步形成了生物被膜附着的条件,随后微生物加速繁殖,加快了对氧气的消耗,导致试验组浸泡部位的微量元素出现了更严重的显色反应,且随龄期增长而加深,在120d时试验组海水浸泡部位已经彻底显深黑色;对照组气液交界面下方在15d时才开始变黑,并且后期同样发生了严重的显色反应,在120d时完全变黑,但是程度略轻于试验组.对照组海水浸泡部位发生显色反应的原因为：15d之后开始有杂菌的引入[17],并且后期逐渐增多,导致对照组也同样会因缺氧而显色.

表2 7、15、120d龄期时试样的宏观形貌

2.3.2砂浆抗压强度

图8给出了各试样的抗压强度.由图8可见：7d 时2组试样抗压强度相差不大.为进一步体现海水环境下砂浆表面生物被膜对试样抗压强度的影响规律,对7d后各龄期试样的抗压强度增长率R进行了计算,结果如图9所示.

图8 各试样的抗压强度Fig.8 Compressive strength of samples

图9 7d后各龄期试样的抗压强度增长率Fig.9 Compressive strength growth rate of samples after 7d

由图8、9可见,试验组的抗压强度总体趋势是增大的,从7d时的51.7MPa增至120d时的68.1MPa,增长了31.72%.推测龄期内可能有少量的硫酸根离子通过生物被膜进入了试样内部,并生成了填充物,使得砂浆内部孔隙更加密实,从而提高了砂浆的抗压强度.而对照组的抗压强度是先增大后降低的,从7d时的52.3MPa增至45d时的60.1MPa,增长了14.91%,期间对照组与试验组的抗压强度相差不大,这是由于期间海水内的硫酸根离子同样进入了对照组试样内部并生成了少量的填充物,从而使得砂浆抗压强度增大.但45d之后对照组的抗压强度开始下降,在120d时其抗压强度仅为52.5MPa,与7d抗压强度相比只增长了0.38%.这可能是由于对照组试样内部填充物在45d 后生成量逐渐增多,使得生成物在填充孔隙的同时,也使孔隙开始产生膨胀倾向,从而使后期抗压强度下降.

2.4 微观分析

2.4.1矿化产物组成

图10是海水环境下砂浆的矿化产物XRD图谱.由图10可见,120d时2组试样在A区域的主要水化产物均为二氧化硅、碳酸钙、石膏和阿利特.二氧化硅大规模的出现是由于试样中使用了河砂,阿利特则是硅酸盐水泥中获得早期强度的主要矿物,石膏是矿化产物中主要的腐蚀产物.由图10还可见,试验组的碳酸钙衍射峰高于对照组,这是由于硫氧化细菌为好氧菌,在附着代谢过程中会消耗氧气并产生大量的二氧化碳,从而使试验组砂浆表面碳化.试验组和对照组试样均没有出现氢氧化钙衍射峰,由此推断出2组试样中均有腐蚀介质进入水泥内部,并与氢氧化钙发生了化学反应,生成了具有膨胀性的石膏.

图10 海水环境下砂浆的矿化产物XRD图谱Fig.10 XRD spectrum of mineralized products of mortar in seawater environment

由图10还可以看出,对照组试样的石膏衍射峰明显高于试验组,这表明进入对照组试样内部的腐蚀性介质更多,因此试样内部生成了更多的石膏,而石膏自身的膨胀性可使砂浆体积增大2.2倍[19].由此可以推测,对照组试样抗压强度降低的原因可能是：砂浆内部形成了更多的石膏,使得内部出现膨胀倾向,而试验组内部生成的石膏量较少,没有出现膨胀倾向.

2.4.2热重分析

图11为120d时海水环境下砂浆试样的TG-DTG曲线.由图11可见：试验组和对照组在180℃附近均出现了石膏的失重峰,并且对照组的失重速率快于试验组：180～200℃范围内试验组和对照组试样中石膏脱水质量损失分别为0.8%、1.7%;610℃附近出现了碳酸钙的失重峰,对照组的失重速率慢于试验组;610～650℃范围内试验组和对照组试样中碳酸钙质量损失分别为1.6%、0.8%.综上,可以确定对照组内部生成的石膏含量多于试验组,这与XRD分析结论一致.

图11 120d时海水环境下砂浆试样的TG-DTG曲线Fig.11 TG-DTG curves of mortar in seawater environment(120d)

综上,海水环境下生物被膜在砂浆表面的附着会影响腐蚀介质的传输,使砂浆的腐蚀进程得以减缓.

3 结论

(1)试验证明了海水环境下硫氧化细菌会在砂浆表面生成大量的生物被膜,主要成分是多糖、蛋白质和微生物.生物被膜中的微生物主要以群落的形式固着在胞外聚合物内,胞外聚合物作为基质彼此相互黏附.

(2)海水环境下砂浆表面的生物被膜在15d之后开始迅速繁殖,到75d时膜层趋于成熟,其厚度达到1.70mm,之后受到营养物质不足的影响,部分生物被膜开始脱落,90d后新的生物被膜重新附着,在120d时其厚度为1.59mm.

(3)120d时试验组抗压强度为68.1MPa,强度增长率为31.72%,石膏脱水质量损失为0.8%;而对照组抗压强度为52.5MPa,强度增长率为0.38%,石膏脱水质量损失为1.7%.这表明生物被膜的存在会影响海水中腐蚀介质的传输,阻碍试样周围的腐蚀介质进入砂浆内部.在海洋实际工程中,生物被膜在构筑物表面附着120d以内时,可考虑保留,暂不对构筑物表面进行除污作业.