益母草碱预处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞存活能力及TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响

胡志良，池 豪，丁水印

1)驻马店市中心医院心血管内科 河南驻马店 463000 2)郑州市中心医院心血管内科 郑州 450000

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是最常见的心血管疾病之一，具有较高的死亡率。通过直接经皮冠状动脉介入治疗进行早期再灌注仍然是MI最有效的治疗方法[1]。然而，再灌注缺血心肌可诱发继发性损伤，即心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤,心肌I/R损伤可导致心肌细胞肥大、心肌纤维化，最终导致心肌细胞死亡。心肌I/R损伤的减轻或消除仍然是MI治疗的重要研究课题。益母草碱(leonurine)是药用植物益母草的主要活性成分，具有活血调经、减轻水肿、抗肿瘤等作用[2-3]。近期有研究[4]证实，益母草碱对缺血心肌具有保护作用。益母草碱能够通过抑制p38MAPK/MEF2信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌重构[5]。本实验通过缺氧/复氧诱导心肌细胞I/R损伤，探究益母草碱预处理对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响及可能的作用机制，以期为心肌I/R损伤的防治提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠心肌细胞H9c2由美国ATCC提供。益母草碱(纯度>97%)由上海思域化工科技有限公司提供。DMEM高糖培养基由美国Life Technologies公司提供；胰蛋白酶、胎牛血清由美国Sigma公司提供；青链霉素双抗由美国Hyclone公司提供； CCK-8试剂盒由南京碧云天生物技术有限公司提供；AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒由日本TaKaRa公司提供；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6 ELISA检测试剂盒由武汉博士德生物有限公司提供；Cleaved Caspase-3、Toll样受体4(toll-like receptor-4，TLR4)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、抑制蛋白IκBα抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗由美国Abcam公司提供；SDS-PAGE配制试剂盒、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒及ECL化学发光试剂盒由上海碧云天生物技术研究所提供。

1.2 缺氧/复氧心肌细胞损伤模型的制备方法H9c2细胞采用DMEM高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)，在37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中孵育。参考文献[6]制备缺氧/复氧心肌细胞损伤模型。H9c2细胞生长融合至95%后，弃旧培养液，加入预先经37 ℃、体积分数为5% CO2和95% N2的混合气体处理的不含血清的DMEM培养液，置于缺氧小室中，通入体积分数为5% CO2和95% N2的混合气体5 min除去氧气，于37 ℃培养箱中缺氧处理3 h。随后将缺氧培养液更换成正常培养液，置于37 ℃、体积分数为95%空气和5%CO2的培养箱中复氧处理2 h。

1.3 实验分组对数期H9c2细胞分为3组：正常对照组、缺氧/复氧组、益母草碱组。正常对照组细胞用正常培养液在37 ℃、体积分数为95%空气和5%CO2的培养箱中培养；缺氧/复氧组细胞按照1.2方法进行缺氧/复氧处理；益母草碱组细胞先以20 μmol/L的益母草碱预处理24 h，然后进行缺氧/复氧处理，益母草碱处理时间及浓度参考文献[7]。

1.4 细胞存活率的检测取对数期的H9c2细胞接种到96孔板中，接种密度为1×104个/孔，过夜培养，待细胞单层融合时按照1.3方法分组处理，每组设置5个复孔，空白对照孔不加细胞。向各孔中加入10 μL CCK-8溶液继续孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的光密度值，计算细胞存活率。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡的AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测H9c2细胞分组处理后，收集细胞，加入适量结合缓冲液悬浮细胞，将细胞密度调整为1×106个/mL。检测管中加入100 μL细胞悬液，再加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和PI染液，避光孵育15 min，上流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。

1.6 TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的ELISA法检测将H9c2细胞以1×104个/孔接种到96孔板中，分组处理，然后收集细胞培养上清，参照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-1β和IL-6含量。实验重复3次。

1.7 细胞中Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB和IκBα蛋白的Western blot法检测分别收集各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，然后取30 μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳，蛋白分离后半干法转膜，用100 g/L脱脂奶粉封闭液封阻1.5 h。TBST洗涤3次，加入稀释过的Cleaved Caspase-3(1∶500)、TLR4(1∶800)、NF-κB(1∶800)和IκBα(1∶800)一抗4 ℃孵育过夜。洗涤后加入1∶3 000稀释的二抗室温孵育1 h。以GAPDH为内参。洗涤后ECL显影，采用GS-800成像系统获取并用Image J分析图像。以目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。正常对照组、缺氧/复氧组、益母草碱组间细胞存活率，凋亡率，细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量，Cleaved Caspase-3蛋白表达、TLR4、NF-κB和IκBα蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组心肌细胞存活能力和凋亡的比较见图1、表1。与正常对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞存活率降低，凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达水平升高(P<0.05)；与缺氧/复氧组相比，益母草碱组细胞存活率升高，凋亡率和Cleaved Caspase-3表达水平降低(P<0.05)；提示益母草碱能够改善缺氧/复氧诱导的心肌细胞活力降低。

1：正常对照组；2：缺氧/复氧组；3：益母草碱组

表1 3组心肌细胞存活率、凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的比较(n=3)

2.2 3组心肌细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的比较见表2。与正常对照组相比，缺氧/复氧组细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量增加(P<0.05)；与缺氧/复氧组相比，益母草碱组TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量降低(P<0.05)；表明益母草碱能够降低缺氧/复氧诱导的心肌细胞炎症因子的释放。

表2 3组心肌细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的比较(n=3) ng/L

2.3 3组心肌细胞中TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达水平的比较结果见图2和表4。与正常对照组相比，缺氧/复氧组细胞中TLR4和NF-κB蛋白表达上调，IκBα蛋白表达下调(P<0.05)；与缺氧/复氧组相比，益母草碱组细胞中TLR4和NF-κB蛋白表达下调，IκBα蛋白表达上调(P<0.05)；表明益母草碱能够有效抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞TLR4/NF-κB信号通路的激活。

1：正常对照组；2：缺氧/复氧组；3：益母草碱组

表4 3组心肌细胞中TLR4、NF-κB和IκBα蛋白表达水平的比较(n=3)

3 讨论

MI等心血管疾病是全世界范围内导致人类死亡的主要原因之一，其发病率和病死率仍在增加，严重影响着人类的健康和生命。心肌缺血后恢复血供造成的再灌注损伤是影响缺血性心血管疾病治疗效果的重要原因，也是临床治疗中的一大难题。因此探究心肌I/R损伤的发病机制，对于寻找相关心血管疾病的有效治疗方案具有重要意义。益母草碱学名为3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基-1-丁酯)，提取自唇形科植物细叶益母草、益母草、艾蒿益母草，具有利水消肿、活血化瘀、抗肿瘤、抗炎等药理学功效[8]。研究[9]发现，益母草碱可用于缺血性脑卒中的治疗。目前关于益母草碱在心血管疾病中的应用受到越来越多学者的关注，但其对心肌I/R损伤的影响及其作用机制尚不明确。

本实验通过缺氧/复氧处理大鼠心肌细胞模拟体内心肌I/R损伤，进而探究益母草碱预处理对心肌I/R损伤的影响及可能的作用机制。本实验结果显示，缺氧/复氧可降低心肌细胞存活率，而益母草碱预处理能够提高缺氧/复氧心肌细胞的存活率。心肌细胞经缺氧/复氧处理后凋亡率明显升高，而益母草碱预处理可减少缺氧/复氧心肌细胞的凋亡。Caspase-3是细胞凋亡过程中的执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色[10]。本实验通过Western blot法检测发现，益母草碱预处理能够减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞中Cleaved Caspase-3蛋白的表达，即抑制了Caspase-3的激活，提示益母草碱可能通过调控凋亡相关蛋白的表达抑制缺氧/复氧心肌细胞凋亡。此外，心肌I/R损伤后可诱导大量炎症因子的释放，引起的炎症反应进一步加重心肌损伤，这也是心肌I/R损伤的主要机制之一[11]。炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等释放量的高低能够在一定程度上反映心肌的受损程度，炎症因子释放量越大，心肌受损程度越严重[12]。本实验ELISA检测结果表明，益母草碱预处理能够明显降低缺氧/复氧心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，这与以往的研究[13]结果(益母草碱能够减少炎症因子分泌)一致。

为进一步探究益母草碱对缺氧/复氧心肌细胞凋亡及炎症反应的影响机制，本实验检测了TLR4/NF-κB信号通路的激活情况。研究[14-15]表明，抑制TLR4/NF-κB信号通路能够抑制I/R诱发的心肌细胞凋亡，抑制炎症级联反应，减轻心肌损伤并改善心脏功能,提示TLR4/NF-κB信号通路在心肌I/R损伤过程中发挥重要作用。本实验结果显示，缺氧/复氧心肌细胞中TLR4和NF-κB蛋白表达明显增加，IκBα蛋白表达下调；而益母草碱预处理可下调缺氧/复氧心肌细胞中TLR4和NF-κB蛋白的表达，上调IκBα蛋白的表达。根据这些数据推测，益母草碱预处理对缺氧/复氧心肌细胞损伤的保护作用可能与阻碍TLR4/NF-κB信号通路的激活有关。