miR-107在TGF-β诱导的NIH-3T3细胞转分化中的作用

裴阳晴，丁明翠，王 迪，郝长付，姚 武

1)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室 郑州 450001 3)上海市宝山区疾病预防控制中心 上海 201901

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种常见的慢性进行性纤维化间质性肺疾病。在IPF过程中，肌成纤维细胞是主要的效应细胞，可以介导纤维的生成、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积以及组织重塑[1]。肌成纤维细胞特征性表达α-SMA，并且具有较高的收缩能力和纤维生成能力；其最常见的来源为肺间质的成纤维细胞[2]。有学者[3-4]报道，成纤维细胞表型转分化的诱导因素主要为细胞因子(IL-10、IL-4)、生长因子(TGF-β)、机械张力等机械因素以及纤连蛋白等细胞外基质蛋白。近年来，随着学者们对基因组研究的深入，越来越多的证据[5]表明miRNA也参与并调节成纤维细胞的转分化过程，主要包括上皮修复、上皮间质转化、成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化等。目前已知的参与调控成纤维细胞转分化的miRNA大多是通过靶向调节TGF-β信号通路实现的[6]；但关于miR-107在肺纤维化疾病中的研究较少，且其在肺纤维化进程中的作用尚不清楚。因此，本研究利用TGF-β诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3转分化，检测细胞中转分化标志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表达水平及miR-107表达水平，探讨miR-107在NIH-3T3转分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料NIH-3T3细胞购自中国科学院细胞库。胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM 培养基、胰蛋白酶、丙酮酸钠、非必需氨基酸(北京索莱宝科技有限公司)，抗GAPDH兔多克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)，抗α-SMA兔多克隆抗体(美国CST公司)，抗Fibronectin兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，抗CollagenⅠ兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，miR-107抑制剂(inhibitor)、miR-107模拟物(mimic)(上海吉玛制药技术有限公司)，荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)，miR-107引物、第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒[(生工生物(上海)工程股份有限公司)]，小鼠重组蛋白TGF-β[(爱必信(上海)生物科技有限公司)]，自动酶标仪(美国SUNRISE公司)，qRT-PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 细胞培养、分组及转染采用完全培养基在含有体积分数5% CO2、37 ℃培养箱中培养NIH-3T3细胞。采用2 μg/L小鼠重组蛋白TGF-β刺激NIH-3T3细胞转分化，分为TGF-β组、对照组；下调miR-107：分为对照组(只加转染试剂)、TGF-β组(转染试剂+2 μg/L TGF-β诱导)、TGF-β+inhibitor-NC组(转染试剂+100 nmol/L miR-107 inhibitor-NC+2 μg/L TGF-β诱导)、TGF-β+inhibitor组(转染试剂+100 nmol/L miR-107 inhibitor+2 μg/L TGF-β诱导)；上调miR-107：分为对照组(只加转染试剂)、TGF-β组(转染试剂+2 μg/L TGF-β诱导)、TGF-β+mimic-NC组(转染试剂+50 nmol/L miR-107 mimic-NC+2 μg/L TGF-β诱导)、TGF-β+mimic组(转染试剂+50 nmol/L miR-107 mimic+2 μg/L TGF-β诱导)。转染后培养48 h进行指标检测。

1.3 各组NIH-3T3细胞中miR-107表达的qRT-PCR检测采用Trizol法提取细胞总RNA，并用Nanodrop 2000检测总RNA纯度和浓度；采用第一链cDNA合成试剂盒进行反转录；采用qRT-PCR法检测miR-107 mRNA的表达。q-PCR反应条件：95 ℃，30 s;95 ℃，3 s；60 ℃，30 s;循环数为40。溶解曲线为仪器默认程序。miR-107上游引物序列：5’-GAGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3’，下游引物为miRNA第一链cDNA合成试剂盒中的通用下游引物。以U6为内参，用2-ΔΔCt计算miR-107表达水平[7-8]。实验重复3次。

1.4 各组NIH-3T3细胞转分化标志物表达的Western blot检测收集各组细胞并提取总蛋白，测定蛋白浓度后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：浓缩胶恒压80 V，当蛋白压成一条线时，电压调为120 V，继续电泳80 min；转PVDF膜，电流为200 mA，100 min。用50 g/L脱脂奶粉液封闭PVDF膜2 h，分别用α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin一抗(均按1∶1 000稀释)和二抗(按1∶5 000稀释)孵育，最后进行ECL显影，应用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析[9-10]。实验重复3次。

1.5 统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。应用两独立样本t检验比较TGF-β刺激后NIH-3T3细胞中miR-107及转分化标志蛋白表达水平的差异，应用单因素方差分析和LDS-t检验分析miR-107 inhibitor/mimic对各组NIH-3T3细胞转分化标志蛋白表达水平的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TGF-β刺激的NIH-3T3细胞中miR-107及转分化标志蛋白表达水平的比较根据课题组前期做过的TGF-β质量浓度梯度结果显示(数据尚未发表)，2 μg/L TGF-β刺激时miR-107水平升高。本研究首先观察了TGF-β刺激对NIH-3T3细胞中miR-107表达水平的影响和NIH-3T3细胞转分化标志蛋白表达水平(表1)。结果显示，相比于对照组，TGF-β组转分化标志物α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。

表1 TGF-β刺激的NIH-3T3细胞中miR-107及转分化标志蛋白表达水平的比较(n=3)

2.2 下调miR-107后各组NIH-3T3细胞转分化标志蛋白表达水平的比较将miR-107 inhibitor转染至NIH-3T3细胞中，48 h后检测细胞中miR-107的水平，TGF-β+inhibitor组(0.290±0.016)NIH-3T3细胞中miR-107表达水平较TGF-β+inhibitor-NC组(1.00±0.035)降低，差异有统计学意义(t=18.430，P<0.001)。Western blot检测结果显示(表2)，与TGF-β+NC组相比，TGF-β+inhibitor组的转分化标志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白水平均降低(P<0.05)。

表2 下调miR-107后NIH-3T3细胞中转分化标志蛋白表达水平的比较(n=3)

2.3 上调miR-107后各组NIH-3T3细胞转分化标志蛋白表达水平的比较将miR-107 mimic转染至NIH-3T3细胞中，48 h后检测细胞中miR-107的水平，TGF-β+mimic组(2.340±0.297)NIH-3T3细胞中miR-107表达水平较TGF-β+mimic-NC组(1.000±0.139)升高，差异有统计学意义(t=4.070，P=0.015)。Western blot检测结果显示(表3)，与TGF-β+NC组相比，TGF-β+mimic组的转分化标志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 上调miR-107后NIH-3T3细胞中转分化标志蛋白表达水平的比较(n=3)

3 讨论

IPF的高危影响因素包括吸烟、粉尘、胃食管反流等；同时，遗传因素、信号传导通路以及细胞因子在IPF的发生发展过程中也发挥着重要作用[11]。TGF-β在炎症反应、损伤的修复以及肺纤维化过程中具有重要作用。目前大多已知的miRNA可通过靶向调节TGF-β信号通路参与调控细胞转分化过程。但miR-107在纤维化疾病中的作用尚不明确。鉴于miRNA与纤维化的密切关系，本研究设计以下实验探讨miR-107在IPF中的作用。

本研究首先利用2 μg/L的TGF-β诱导NIH-3T3细胞转分化，收集培养48 h的细胞，检测发现TGF-β刺激的NIH-3T3细胞中miR-107的相对表达水平明显升高。且Western blot结果显示，相比于对照组，TGF-β组转分化标志物α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表达水平明显升高，说明2 μg/L的TGF-β诱导48 h可以成功诱导NIH-3T3细胞转分化。以往有研究[12]显示，miR-107靶向PCDH17表达调控EMT通路，从而调控胃癌细胞迁移及侵袭。在结肠癌组织和细胞中miR-107过表达，并通过上调细胞周期蛋白D1的表达进而促进HT29细胞的增殖和肿瘤的形成[13]。目前，miR-107在IPF中的作用机制尚不明确，但本研究以及上述研究均表明miR-107在IPF、胃癌以及结肠癌中表达上调。

近年来，大量的研究[10，14-16]表明miRNA在纤维化的发生发展中发挥关键作用：miR-29b-3p在多种纤维化模型和人类纤维化疾病中呈现低表达；miR-133a使TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化标志物α-SMA、CTGF和胶原蛋白表达下调。有研究[17]显示，miR-15a的治疗性修复可抑制小鼠肺成纤维细胞中的纤维生成，并消除博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。本研究为了进一步探讨miR-107在IPF中的作用，采用miR-107 inhibitor和miR-107 mimic分别转染TGF-β刺激的NIH-3T3细胞，检测miR-107的表达水平，观察其对IPF进程的影响。结果发现抑制miR-107后，NIH-3T3细胞转分化的相关标志蛋白α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin表达水平降低；而上调miR-107使NIH-3T3细胞转分化的相关标志蛋白α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin表达水平升高。说明miR-107在TGF-β诱导的NIH-3T3细胞转分化过程中具有调节作用。

综上所述，miR-107对TGF-β诱导的NIH-3T3细胞IPF进程具有一定的作用，抑制miR-107的表达可以抑制TGF-β诱导的NIH-3T3细胞转分化过程。成纤维细胞的转分化在IPF的发生发展中发挥着重要作用，研究成纤维细胞的转分化过程将有助于对纤维化疾病的了解，为IPF的研究和治疗提供新的思路。