高氨诱导的肝细胞中凋亡相关LncRNA表达谱的变化

杨荟玉，张远英，周恩慧，龚美源，孔令建，刘冰熔

1)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学华大基因学院 郑州 450052 3)郑州大学药学院 郑州 450052

肝功能衰竭(肝衰竭)是严重的进行性肝病。肝衰竭时大量肝细胞坏死、凋亡，残存的肝细胞不能满足机体需求，导致相关代谢功能紊乱，紊乱的代谢产物在体内堆积对肝细胞造成二次损伤，即“二次打击”学说，这被认为是肝衰竭发生发展的重要机制之一[1-2]。高氨血症是肝衰竭最常见的代谢紊乱[3]。我们前期的研究[4-6]结果表明，血氨升高可以诱导细胞凋亡而致肝细胞损伤，对肝细胞造成“二次打击”，但机制尚不完全清楚，因此迫切需要新的策略进行机制研究，从而为治疗奠定理论基础。

长链非编码RNA (long non-coding RNA，LncRNA)长度通常超过200个核苷酸，无蛋白编码能力。越来越多的证据[7-8]表明，LncRNA参与了许多重要的生物学过程，其表达失调已被证明与许多人类疾病相关。我们应用人凋亡通路LncPathTM芯片筛选出高氨诱导肝细胞中的差异表达LncRNA，通过GO和KEGG通路分析预测这些差异表达LncRNA的生物学作用和涉及的信号通路，并对LncRNA及与其相关的mRNA进行整合分析，探究差异表达LncRNA在高氨诱导肝细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及分组人正常肝细胞LO2购自中国科学院细胞库(上海)。胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司。氯化铵购自上海生工生物工程有限公司。细胞用含青/链霉素、体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。然后将细胞分为3组：对照组按上述方法常规培养；高氨1组、高氨2组参考文献[9]的方法分别用10 mmol/L氯化铵溶液诱导24、48 h，以制备高氨肝细胞模型。

1.2 差异表达LncRNA和mRNA的筛选应用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)分别常规提取3组细胞的总RNA，使用NanoDrop2000对每个样品进行定量分析。人凋亡通路LncPathTM芯片由上海康成生物科技有限公司制作并测序完成：使用安捷伦芯片平台，用Arraystar Flash RNA标记扩增总RNA并转录，将产物杂交到人凋亡通路LncPathTM芯片上，用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪扫描芯片，记录LncRNA或mRNA表达变化比值(FC)。应用R limma软件包对原始数据进行分位数归一化处理，然后采用两独立样本的t检验比较两组间LncRNA或mRNA的表达水平。以log2FC≥2且P<0.05为差异表达。

1.3 3组细胞中部分差异表达LncRNA表达水平的检测随机挑取在3组中均差异表达的5个LncRNA进行实时荧光定量PCR检测。采用Primer Express 5.0(美国Applied Biosystems)对所选差异表达LncRNA和管家基因GAPDH进行引物设计，序列见表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

第一链cDNA合成试剂盒及PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。PCR反应体系：2×Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O补足至20 μL。 采用ABI 7 PCR系统，反应条件：95 ℃预变性10 min;95 ℃10 s，60 ℃60 s,40个循环。反应结束后，95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，建立熔解曲线。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因表达水平。3组间目的基因表达水平的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α=0.05。

1.4 GO注释和KEGG通路分析应用GO注释(http://www.geneontology.org)和KEGG通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)探索3组细胞中差异表达LncRNA和mRNA参与的生物学过程及通路。

1.5 LncRNA与mRNA整合分析通过平行量化LncRNA及其潜在靶基因，得到具有共表达关系的LncRNA-mRNA关系对，从中筛选受到共同差异表达miRNA调控的LncRNA-mRNA关系对，使用Cytoscope构建ceRNA网络图。

2 结果

2.1 差异表达LncRNA和mRNA的筛选LncRNA和mRNA的表达变化散点图见图1。3组间差异表达的LncRNA有8个，差异表达的mRNA有13个，见图2、表2和表3。

图2 3组间差异表达的LncRNA(A)和mRNA(B)

表2 3组差异表达LncRNA

表3 3组差异表达mRNA

2.2 差异表达LncRNA表达的验证5个差异表达LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP43410714、AC006978.6和SNAR-A2的实时荧光定量PCR检测结果与测序结果一致，表达水平见表4。

表4 LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP434I0714、AC006978.6和SNAR-A2在3组细胞中的表达

2.3 GO注释和KEGG通路分析见图3。GO注释结果显示，3组的差异表达LncRNA及mRNA主要参与了细胞凋亡、细胞程序性死亡、细胞死亡、细胞程序性死亡负调控、生物过程负调控、凋亡过程调控等生物学过程。KEGG分析结果显示，3组的差异表达mRNA参与的信号通路包括孕激素介导的卵母细胞成熟通路、神经营养因子信号通路、卵母细胞减数分裂和MAPK信号通路；差异表达mRNA MAPK12和RPS6KA3均参与了这4条通路。

图3 GO注释(左)和KEGG通路分析(右)结果

2.4 LncRNA与mRNA整合分析结果高氨1组与对照组差异表达的LncRNA有60个，差异表达的mRNA有84个；其中LncRNA靶向的mRNA有63个，mRNA对应的LncRNA有39个。高氨2组与对照组差异表达的LncRNA有87个，差异表达的mRNA有66个；其中LncRNA靶向的mRNA有33个，mRNA对应的LncRNA有33个。高氨2组与高氨1组差异表达的LncRNA共153个，差异表达的mRNA有114个；其中LncRNA靶向的mRNA有62个，mRNA对应的LncRNA有65个。ceRNA网络图见图4。3组细胞中，LncRNA BAIAP3与MAPK12 mRNA关联。

长方形代表LncRNA，三角形代表miRNA，椭圆代表蛋白质

3 讨论

肝衰竭可引起肝细胞大量坏死和凋亡，由于“残留”的肝细胞不能满足机体的需要，机体会出现一系列代谢功能障碍，其中最常见的是血氨增高。D氨基半乳糖和脂多糖诱导的急性肝衰竭大鼠模型显示，肝细胞凋亡是模型大鼠重要的病理改变，降低血氨可以预防肝细胞损伤和凋亡[10]。研究[9]发现10 mmol/L氯化铵溶液是体外高氨肝细胞模型建模的理想浓度；氯化铵能明显诱导人肝细胞凋亡，但对其他细胞类型影响不大，可能与氨能显著影响肝细胞RHCG、AQP8的表达有关。

在本研究中，我们用10 mmol/L氯化铵溶液诱导24、48 h建立高氨肝细胞模型，以分析高氨诱导肝细胞凋亡过程中LncRNA表达谱的变化。 结果显示，对照组、高氨1组(诱导24 h)和高氨2组(诱导48 h)共有8个LncRNA和13个mRNA表达有显著差异。与对照组相比，高氨1组LncRNA AF520792、CYCSP55、DKFZP434I0714、AC006978.6表达下调，而其在高氨2组表达上调；MEG3在高氨1组表达上调，而在高氨2组表达下调；两组SNAR-A2表达均下调，XLOC_008935、CRNDE均上调。与对照组相比，高氨1组RPS6KA3、BUB1B、SON、USP9X mRNA表达下调，而其在高氨2组表达上调；SSTR3、EDAR、CRYAB、DCC、TNFSF12、SST mRNA在高氨1组表达上调，而在高氨2组表达下调；两组MAPK12 mRNA表达均下调，TSC22D3、DHCR24 mRNA表达均上调。这些结果表明，随着氯化氨处理时间的变化，肝细胞LncRNA和mRNA的表达谱也随之发生变化。短期的氯化铵诱导后，肝细胞开始启动防御机制，防止细胞凋亡；随着诱导时间的延长，防御被破坏，肝细胞凋亡加剧；这也与早期降氨治疗肝衰竭患者预后良好相对应。我们选出5个失调的LncRNA进行实时荧光定量PCR检测，结果证实了芯片测序的结果。本研究结果提示LncRNA SNAR-A2、XLOC_008935、CRNDE和MAPK12、TSC22D3、DHCR24 mRNA可能在高氨诱导的肝细胞凋亡中起重要作用。

我们对筛选出的LncRNA及相关的mRNA进行了GO注释和KEGG通路分析。结果显示，在这些基因参与的多条信号通路中MAPK12和RPS6KA3这两个基因均有异常表达，表明MAPK12和RPS6KA3可能在高氨诱导的肝细胞凋亡中起重要作用；氨可能通过靶向MAPK12对肝细胞造成损伤。ceRNA网络分析结果表明LncRNA BAIAP3与MAPK12 mRNA关联，提示LncRNA BAIAP3可能通过靶向MAPK12参与MAPK信号通路，从而在高氨诱导的肝细胞凋亡中发挥重要作用，其确切机制还需要进一步探索。

本研究仅对肝细胞模型进行了分析，具有一定的局限性，肝衰竭患者血液和肝脏中的整体LncRNA和mRNA变化还需进一步的研究确定，以更准确地反映高氨诱导肝细胞凋亡的病理生理机制。