生物降解高分子缓控释材料与土壤微生物的互作关系

范海瑞，刘亚青

(中北大学 材料科学与工程学院，山西 太原 030051)

0 引 言

含营养元素的化肥材料在我国粮食增产中发挥了至关重要的作用[1-2]. 传统肥料主要以尿素、 过磷酸钙、 磷酸二铵以及复合肥为主，水溶性较高，营养元素单一[3]，在实际应用中，大量的营养物质和未被吸收的组分会随着浇灌流入生态系统的水体循环中[4]，对环境造成了严重污染. 为了解决传统化肥的营养结构不合理、 复合性不高、 部分物质难分解等问题，研究者们开发了一系列的生物降解高分子缓控释材料，将它们用作肥料施入土壤，既可以实现养分的缓慢释放，满足植物生长周期所需的养分，又可以实现完全生物降解，不对环境造成污染[5]. 保水剂(SAP)有提高土壤保水能力和水分利用率、 改善土壤结构等作用[6-7]. 因此，研究者们将其与缓控释肥料结合起来，以实现水肥一体化，从而在不污染环境的前提下，达到改善土壤理化性质，增加作物产量的目的[8].

根据美国ASTM定义，生物降解高分子材料是指在一定条件下，一定时间内能被微生物(细菌、 真菌、 霉菌、 藻类等)或其分泌物在酶或化学分解作用下降解的高分子材料[9]. 由此可知，微生物对于生物降解高分子材料的降解起到了非常重要的作用. 土壤微生物在有机质分解、 矿质养分释放和养分循环中起着核心作用. 近年来，土壤微生物多样性的研究得到了广泛的关注，研究降解微生物的群落结构、 材料和降解微生物对土壤微生物的影响对于基于生物降解高分子材料的缓控释化肥的研究与开发具有参考意义. 大多数学者研究了生物降解高分子缓释肥料对植株和土壤理化性质的影响[10]，其降解微生物和对土壤微生物的影响也同等重要. 因此，本文选择了实验室(山西省高分子复合材料工程技术研究中心)自主研发的3种不同生物降解高分子材料(含NPK的生物降解高分子缓释材料(PSRF)、 保水剂聚(丙烯酸-co-丙烯酰胺)(SAP)、 PSRF和SAP通过氢键相互作用形成的具有半互穿网络结构的保水生物降解高分子缓控释材料(SI-PSRF/SAP))进行了实验. 由于课题组之前研究了这3种材料对土壤理化性质和植株的影响，综合分析最优材料是SI-PSRF/SAP[11]，为了分析其对土壤生物肥力的影响，本文主要分析降解微生物的群落结构. 由于这3种材料都作为肥料施入了土壤中，因此，为了更好地研究它们对土壤肥力的影响，选取降解周期短且为SI-PSRF/SAP基础组分之一的PSRF为代表进行土壤降解实验，以研究PSRF和降解PSRF的微生物对土壤肥力的影响.

1 材料与方法

1.1 供试土壤

土壤样品采自山西省太原市尖草坪区上兰村农田耕地表层0 cm～20 cm的土壤，类型为褐土，基本理化性质为砂粒38%, 粉粒50%, 粘粒12%，pH=7.87，有机质含量为18.01 g/kg，所采土壤自然风干后，过2 mm筛备用.

1.2 材料的制备

生物降解高分子缓控释材料由山西省高分子复合材料工程技术研究中心提供. 含NPK的生物降解高分子缓释材料(PSRF)由尿素、 甲醛、 磷酸二氢钾等合成； 保水剂聚(丙烯酸-co-丙烯酰胺)(SAP)由丙烯酸和丙烯酰胺等合成； PSRF和SAP通过氢键相互作用形成的具有半互穿网络结构的保水生物降解高分子缓控释材料(SI-PSRF/SAP)由尿素、 甲醛、 丙烯酸、 丙烯酰胺等合成[12]，图1 为PSRF和SAP的分子结构式以及SI-PSRF/SAP的结构示意简图.

(a) PSRF

(b) SAP

(c) SI-PSRF/SAP

1.3 培养基的制备

实验前，制备了矿物盐培养基和牛肉膏蛋白胨培养基. 矿物盐培养基的制备步骤具体为：将0.7 g K2HPO4，0.7 g KH2PO4·12H2O，1 g (NH4)2SO4，0.7 g MgSO4，0.005 g NaCl，0.002 g FeSO4·7H2O，0.001 g MnSO4·H2O 和 0.002 g ZnSO4·7H2O溶解于1L蒸馏水中[13]. 牛肉膏蛋白胨培养基的制备步骤具体为：将牛肉提取物(3 g)、 蛋白胨(10 g)和NaCl (5 g)加入1 L蒸馏水中，调整pH值为7. 所有悬浮液用无菌滤膜密封，121 ℃高压30 min，室温冷却，4 ℃冰箱保存至使用. 以上原料均从天津大茂化学试剂厂购得，且均为分析纯.

1.4 土壤中降解微生物的收集和富集

三种材料(颗粒状、 5 g)分别装入300目尼龙网袋中，再分别放入装有500 g土的容器正中间，使土壤含水率达到40%，室温培养一个月，则能够降解材料的微生物会附着于材料表面. 1个月后将材料取出，在20 mL无菌水中以16 kHz(超声频率不宜过高，否则会对微生物造成伤害)超声处理10 min，材料表面的微生物进入超声液中，将其作为接种液用于下一步实验[14].

通过将材料作为唯一碳源来分离出能够降解材料的微生物. 将1 mL接种液加入到含有材料(10 g/L)的100 mL灭菌矿物盐培养基中，并且将混合物置于30 ℃下、 以200 r·min-1转动的旋转振荡器上、 黑暗中温育7 d. 之后以上一次的培养液作为接种液(1mL)在补充有新的相同材料浓度(10 g/L)的相同矿物盐培养基中进行富集培养. 这一步骤重复至少5次，以消除任何来自土壤样品的有机物杂质的影响. 分离出来的降解微生物用于之后的鉴定[15].

1.5 降解实验

为了研究PSRF以及PSRF的降解微生物对土壤微生物的影响，在土壤中进行了降解实验. 将最后一次富集的培养液1 mL接种到100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃、 以 200 r·min-1转动的旋转振荡器上、 温育2 d，将其作为菌悬液(BS)用于下一步的土壤降解实验，菌悬液浓度为2.3× 108CFU/L.

在100 mL培养瓶中进行了土壤降解实验. 每个瓶中加入100 g土，使土壤含水率保持到40%. 进行3组处理，每组处理重复18次. 3组处理分别是：加入1 mL菌悬液(BS)、 1 g材料(PSRF)和空白对照(CK)，为了保持每组处理的一致性，加入PSRF的处理和CK都加入了1 mL新的不含降解微生物的牛肉膏蛋白胨培养基. 在25 ℃下培养，在第10天, 25天, 40天, 70天, 85天, 100天取样，进行测试分析.

1.6 结构表征

用扫描电子显微镜(SEM, Hitachi SU8010)表征材料表面形貌的变化； 用红外光谱仪(FTIR, Nicolet IS50)表征材料表面的官能团，扫描波数范围为650 cm-1～4 000 cm-1.

1.7 测定方法

1.7.1 失重率

失重率(%)=(M0-Mi)/M0×100%，

(1)

式中：M0和Mi分别为材料降解前后的质量；i为降解第15天, 25天, 40天, 70天, 85天, 100天.

1.7.2 微生物生物量碳测定

采用氯仿熏蒸萃取法[16]提取土壤微生物量碳. 将5 g干土壤样品置于50 mL离心管中，先加去离子水1 mL～3 mL至土壤表面出现薄薄的水层，然后在25 ℃下用氯仿(无乙醇)熏蒸24 h. 除去熏蒸剂后，用20 mL 0.5 mol/L的K2SO4溶液浸提，随后将浸提液放置在95 ℃水浴中60 min. 并以300 r·min-1的速度置于水平培养箱振荡器(KuhnerSHAKERX)上30 min并过滤. 未熏蒸的部分也以相同的方式浸提. 用总有机碳分析仪(TOC)(Elementarvario TOC，德国)测定浸提液中的C含量. 采用下列公式计算得到微生物量碳

MBC=Ec/KEC,

(2)

式中：MBC为微生物量碳(mg/kg)；Ec为碳浓度值(mg/kg)，Ec=熏蒸后提取的碳含量-非熏蒸后提取的碳含量；KEC为转换系数(0.45).

1.7.3 微生物生群落和功能分析

采用E.Z.N.A.© Soil DNA Kit提取试剂盒提取基因组DNA，采用引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT对16S V3～V4区进行聚合酶链反应(PCR). 这些样本分别用条形码编码，以实现多重测序. PCR反应在20μL主混合物中进行，该混合物含有4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，8 μL Forward Primer(5 μmol/L)，0.8 μL Reverse Primer(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu Polymerase, 0.2 μL Template DNA和10 ng模板DNA. 扩增过程：在95 ℃下3 min变性，95 ℃下30个循环，每个循环30 s； 55 ℃ 30 s； 72 ℃ 45 s； 72 ℃下10 min； 温度降到10 ℃停止. 然后利用Illumina MiSeq平台对这些标记有不同条形码的DNA进行测序. 使用UPARSE对操作分类单元进行聚类，相似度截断率为97%. 利用RDP分类器对这些OTUs序列的门、 科、 属进行了分类. 使用BLAST程序将数据与SILVA核糖体RNA序列数据库进行比对，并且通过IQ-TREE构建系统发生进化树. 采用PICRUSt方法进行功能分析.

1.8 数据分析

使用Excel 2016软件对原始数据进行整理计算，并用Origin 9.0软件绘制图形.

2 结果与讨论

2.1 SEM分析

使用SEM对PSRF、 SAP和SI-PSRF/SAP进行形貌分析. 如图2 所示，干燥的PSRF表面有些粗糙，这是由于表面形成了结晶颗粒； SAP表面非常平整，而干燥的SI-PSRF/SAP表面有许多无规的褶皱和凸起，SI-PSRF/SAP形貌上的变化主要是由于SI-PSRF/SAP中的内部交联点增多引起的，SAP中穿插的PSRF分子链可以充当凝胶网络的物理交联点，而额外的未与SAP交联的PSRF分子链会吸附在SI-PSRF/SAP表面形成无规则的集聚体，加上SAP和PSRF的缠结作用就形成了褶皱[17]. 已有研究表明，材料表面越粗糙，越有利于微生物的定植[18]. 而SI-PSRF/SAP表面有许多无规的褶皱和凸起，增大了微生物与材料的接触面积，更有利于微生物定植于材料的表面.

图2 PSRF, SAP和SI-PSRF/SAP的SEM图

2.2 FTIR分析

如图3 所示，在3 329 cm-1处的强吸收峰是PSRF的仲酰胺伸缩振动吸收峰； 在3 349 cm-1和3 182 cm-1附近的特征峰是SAP中-CONH2基团的 -NH 伸缩振动； 在1 657cm-1和1 551cm-1附近的特征峰分别是-CONH2基团的 -C=O 和 -COO- 不对称吸收振动[18]. SI-PSRF/SAP明显地包含PSRF和SAP的所有特征峰，表明SI-PSRF/SAP同时含有PSRF和SAP两种分子. PSRF含有氮磷钾营养元素，易于被微生物吸收利用，同时SAP是一种吸水保水材料，可以为微生物提供生长所需要的水分，而SI-PSRF/SAP同时含有PSRF和SAP两种分子，说明SI-PSRF/SAP更有利于微生物的生长繁殖.

图3 材料的FTIR光谱图

2.3 降解材料的微生物群落结构分析和功能预测

表1 PSRF, SAP和SI-PSRF/SAP的群落组成

从表1 可以看出，从属水平上，降解PSRF的微生物主要是Sphingomonas，Methylobacterium-Methylorubrum，Brevundimonas和Acinetobacter，相对丰度分别为46.49%, 20.62%, 8.51% 和7.79%. 降解SAP的微生物主要是Methylophilus，Rhodococcus，Nubsella和Nocardioides，相对丰度分别为34.13%, 10.04%, 9.92%和6.21%. 降解SI-PSRF/SAP的微生物主要是Methylophilus，Nubsella，Ensifer和Delftia，相对丰度分别为21.10%, 13.19%, 11.88% 和8.71%. 降解三种材料的微生物群落有相同部分，如Delftia，Ensifer和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，这是由于三种材料的分子结构有相同的部分，可满足这些微生物生长繁殖的需求. 降解SI-PSRF/SAP微生物与降解PSRF和SAP的微生物群落组成较为相似，并且与降解SAP微生物的群落组成相似性更高. 这是因为SI-PSRF/SAP主要是由SAP和PSRF通过氢键相互作用形成的，基本含有SAP和PSRF的官能团和分子结构，并且SI-PSRF/SAP和SAP都是网状的吸水性材料，含有更多的亲水官能团，分子结构更为相似.

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标. chao，shannon，ace，simpson和coverage是常用的度量标准，chao，shannon，ace和coverage越高说明Alpha多样性越高，simpson越低说明Alpha多样性越高. 从表2 可以看出，微生物Alpha多样性：SI-PSRF/SAP>SAP>PSRF. 这主要是因为在培养过程中，除了矿物盐外，材料是唯一的微生物可利用能源，而PSRF的分子链为线性单链结构，并且含有的亲水官能团只有羰基和氨基，结构较为简单，虽然容易降解，利于微生物快速繁殖，但降解微生物种类较少. 而SI-PSRF/SAP和SAP为网状结构，结构复杂，含有更多的亲水官能团，如羰基、 氨基、 羟基等，虽然不易降解，但能满足更多种类微生物的需求，所以含有更多种类的降解微生物. 此外，SI-PSRF/SAP是半互穿网络结构，结构更为复杂，还含有微生物生长繁殖所需的P和K元素，所以降解微生物种类最多. 由图4 可以看出，在功能丰度上，降解SI-PSRF/SAP和SAP微生物的功能丰度是相近的，并且远大于降解PSRF微生物的功能丰度，这主要是因为微生物的功能丰度在一定程度上与微生物多样性成正相关关系[19]. 由于降解SI-RSRF/SAP和SAP微生物的功能丰度相近，但降解SI-RSRF/SAP微生物的Alpha多样性高于降解SAP微生物的Alpha多样性，而微生物的多样性反映了土壤微生物群落结构的稳定性，同时也反映了土壤的生态机制以及微生物对土壤胁迫的响应，说明降解SI-RSRF/SAP的微生物群落更稳定，不易受外界的干扰； 土壤微生物是土壤中最为活跃的部分，不仅参与了土壤中包括养分的分解、 转化和循环、 能量流动等几乎所有的生命过程，还可以储备植物的有效养分，并通过生命活动产物丰富土壤的有机部分，土壤微生物多样性影响土壤的生物肥力，是土壤肥力的一部分[20]. 故SI-RSRF/SAP更有利于土壤肥力.

表2 降解微生物Alpha多样性指数表

图4 不同微生物群落功能差异

(a) PSRF

(b) SAP

(c) SI-PSRF/SAP

系统发育树是生物信息学中描述不同生物之间相关关系的方法，如图5 所示，通过系统发育树可以了解降解同一种材料的微生物之间的血缘关系，并且微生物之间亲缘关系越近，功能越近，可由此推断未知微生物的功能. 由图5 可知：降解PSRF的主要微生物来自6个纲； 降解SAP的主要微生物来自5个纲； 降解SI-PSRF/SAP的主要微生物来自4个纲； 并且都是来自Deinococci，Actinobacteria，Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Bacilli和Bacteroidia. 说明降解这三种材料的微生物的亲缘关系都很近，虽然PSRF的微生物Alpha多样性是最低的，但其易降解，其主要降解的微生物来自6个纲，来源比较广.

2.4 降解实验中微生物生物量碳的变化

微生物生物量碳是土壤中比较活跃的碳，在一定程度上可以反映微生物数量. 由图6 可以看出，3组处理的微生物生物量碳都有一定的增长，但是增长幅度不同，PSRF>BS>CK. 对于CK，由于温度和湿度适宜，0 d～40 d微生物大量繁殖，微生物生物量碳呈上升趋势，含量最高达到225.32 mg/kg.

(a) 生物量碳含量

(b) PSRF失重率

40 d后微生物适应了当前环境，其数量保持在恒定的范围，故微生物生物量碳在190.80 mg/kg～200.70 mg/kg内维持稳定； 对于BS，其规律和空白对照相似，但增长幅度大于CK. 因为BS包含了降解PSRF的微生物，施入土壤后能直接增加微生物数量，从而增加微生物生物量碳含量，并且BS包含很多优势种群，能更好地利用土壤有机质，加上环境适宜，微生物大量繁殖，故0 d～40 d的增长幅度大于CK，含量达到318.84 mg/kg. 40 d后由于微生物的自我调节能力，适应了当前的环境，其数量保持在恒定的范围，故微生物生物量碳在304.70 mg/kg～325.64 mg/kg 内维持稳定； 对于PSRF，在加入PSRF的0 d～75 d内，微生物生物量碳的含量一直增加，并且增长幅度大于BS和CK，含量最高可达到502.42 mg/kg. 这是因为PSRF作为易降解的外源碳，其中包含了微生物生长所需元素，加入土壤后能很好地刺激微生物生长，从而增加微生物生物量碳的含量，75 d后PSRF基本不再降解，失重率一直稳定在83.20%，由于缺少PSRF这部分能源，微生物数量呈现一定的下降趋势. 直至85 d时，微生物适应了当前环境，其数量保持在恒定的范围，故微生物生物量碳在426.25 mg/kg～440.95 mg/kg内维持稳定.

2.5 降解实验中微生物群落组成和功能预测

微生物多样性在一定的程度上可以代表土壤肥力，本文研究了100 d时降解实验中各处理微生物Alpha多样性并预测了其功能. 从表3 可以看出，无论是PSRF还是BS的加入，都会降低微生物Alpha多样性，这与微生物生物量碳的规律是不同的. PSRF的加入会降低微生物Alpha多样性主要是因为PSRF作为一种易降解的物质，微生物很容易将其作为能源进行生命活动和自身繁殖，这样微生物无需降解一些难降解的物质来用于生命活动和自身繁殖，从而导致微生物活性降低，而能降解PSRF的微生物和优势种群就会大量繁殖，劣势和适应能力差的种群会减少甚至消失，从而导致微生物Alpha多样性降低. BS的加入也会降低微生物Alpha多样性，这主要是因为BS作为外来物种会与土壤本地物种形成竞争关系，竞争营养元素和栖息地等. 这样BS中的外来优势物种会利用土壤中的有机质大量繁殖，而土壤本地劣势和适应能力差的物种会因缺少资源而减少甚至消失，从而导致微生物Alpha多样性降低. 相比于PSRF，BS的加入会造成更低的微生物Alpha多样性，说明外来物种入侵对土壤微生物Alpha多样性的影响要大于材料施入对微生物Alpha多样性的影响.

由图7 可以看出，在100 d时的微生物功能丰度上，CK>PSRF>BS. 这主要是因为微生物的功能丰度在一定程度上与微生物种群多样性成正相关关系.

表3 土壤降解实验Alpha多样性指数表

图7 不同处理微生物群落功能差异

3 结 论

本文分析了降解PSRF、 SAP和SI-PSRF/SAP这三种材料的微生物群落结构以及PSRF和降解微生物与土壤微生物的互作关系. 结果表明：降解SI-PSRF/SAP的微生物Alpha多样性高于SAP和PSRF，而功能丰度上SI-PSRF/SAP和SAP相近，且远大于PSRF，说明SI-PSRF/SAP更有利于土壤的肥力； PSRF以及降解PSRF的微生物施入土壤后都会增加微生物的数量，但会降低微生物Alpha多样性. 本文研究结果可为人们从微生物的角度分析生物降解高分子缓控释材料对土壤肥力的影响和开发基于生物降解高分子材料的缓控释化肥提供参考.