香樟叶提取物对植物病原菌的生物活性研究

黄祚骅，邹嘉伟，周文娟，刘骏晴，阮诗琪，倪林*，邹双全*

(1.福建农林大学林学院，福州 350002；2.福建农林大学植物保护学院，福州 350002；3.福建医科大学药学院，福州 350002)

香樟(Cinnamomumlongepaniculatum)属樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物，主要分布于中国长江以南地区，为中国特有树种[1]。香樟植株的根、茎、叶均含有不同含量的1，8-桉叶油素、α-萜品醇及香桧烯等精油成分。香樟资源较为丰富，已成为香料、医药、日用和化工产品的重要原料来源[2]。目前对香樟的研究主要集中在精油提取、精油成分及生理功能等方面。杜永华[3]等通过系统预试和专项预试相结合的方法分析提取芳香精油后的残渣化学成分，结果表明其含有有机酸、酚、黄酮、甙类、甾体、三萜、内酯、香豆素等成分，具有抑菌[4-5]、抗炎[6]、抗油脂氧化[7-8]、抗肝癌[9-10]等生理活性。国内外研究显示香樟叶对多种真菌病害具有抑制作用[11]。陶翠等[12]研究表明，香樟叶油枯萃取相对须毛癣菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌3种真菌具有一定的杀菌作用。李苗等[13]从油樟叶片中分离的油樟真菌 YZP-01以及常见植物病原真菌绳状篮状菌(Talaromycesfuniculosus)、拟轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioides)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)四种致病菌株进行了拮抗试验，发现了该菌株具有广谱且良好的拮抗病原菌活性。因此香樟萃取相具备开发为植物病原菌杀菌剂的潜力。瓜果腐霉病菌是鞭毛菌亚门的植物病原真菌，可危害瓜类、茄科、烟草、玉米、棉花、甜菜等多种重要经济作物，引起幼苗猝倒、根茎和瓜果腐烂等病害症状，造成严重经济损失[14]。茄链格孢菌是重要的植物病原真菌之一[15]，属于半知菌链格孢属，该属真菌能引起许多重要作物病害，如番茄、辣椒、马铃薯等茄科农作物，直接危害作物果实[16]，引起农作物减产，给种植户造成极大的经济损失。本研究以香樟枝叶提取精油后的提取液为材料，经大孔吸附树脂吸附、95%乙醇洗脱、有机溶液萃取等一系列操作得到香樟馏分，对不同部位馏分进行抑菌活性研究，为进一步综合利用香樟资源，减少排放的香樟提取液对环境的破坏，使其变废为宝，为植物真菌病害的绿色防治提供科学依据，为香樟叶的深度利用提供参考。

1 实验方法

1.1 试剂与仪器

实验仪器有：TQ系列多功能提取罐(厦门百盛捷自动化设备有限公司)；QWZL-300直线往复式切药机(台州春江制药机械有限公司)；低温冷却液循环泵(上海一凯仪器设备有限公司)；高低温循环装置(上海一凯仪器设备有限公司)；SC-CJ-2FD 型双人单面净化工作台(苏州净化设备厂)；GR85DF 型高压灭菌锅(美国致微仪器有限公司)；CPA225D 型电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；KQ500DE 型数控超声波清洗机(昆山超声仪器公司)；Buchi Rotavapor Essential 旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)。有机溶剂有甲醇、石油醚、乙醇、乙酸乙酯等(西陇化工有限公司)。

1.2 材料与菌种

香樟样品于2019年7月采摘于福建连城，树龄3 a。样品经福建农林大学邹双全教授鉴定为樟科樟属香樟。样品存放于福建农林大学植物保护学院制药工程专业实验中心。

供试菌种为茄病镰刀病菌(Fusarium solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、茄链格孢病菌(Alternaria solani)，由福建农林大学教育部生物农药与化学生物学重点实验室提供。

1.3 提取分离

阴干粉碎香樟枝叶121.71 kg，经100 ℃饮用水回流提取3 h，回收提取液，经大孔树脂吸附后用95%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得1.8 kg浸膏。取1.4 kg浸膏经甲醇溶解后，与4.4 kg硅藻土拌样；依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇萃取，减压回收溶剂，分别得到石油醚萃取相64.96 g、乙酸乙酯萃取相404.48 g、乙醇萃取相528.95 g备用。

1.4 香樟萃取相抑菌活性检测

分别称取2.0 g供试植物石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、乙醇萃取相溶解于分析纯DMSO溶液中，超声辅助溶解制成100 mg/mL的粗提物母液，配置成2.0 mg/mL的含药培养基，以含等浓度的分析纯DMSO的培养基为对照，每个处理重复3次，接种培养。采用菌丝生长速率法[17]测定对5种供试植物病原真菌的抑制活性，计算抑菌率。

1.5 香樟提取物毒力测定

采用菌丝生长速率法测定活性部位对目标菌种的毒力大小，将提取物用50%乙醇水溶解，超声辅助溶解配置成提取物母液。设置不同浓度梯度，最终配置成浓度0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL的含药培养基。以含等浓度的50%甲醇水培养基为对照，每个处理重复3次，接种培养。测定抑菌活性并计算毒力回归方程、相关系数以及抑制中浓度(EC50)，用 EXEL 2016 软件进行数据统计，运用 SPSS 2020 统计软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 香樟粗提物抑菌活性筛选

采用生长速率法测定了香樟3个部位浓度2 mg/mL的提取物对5种植物病原真菌的抑菌活性，测定结果表明香樟提取物对5种真菌均有抑制活性，其中石油醚部位提取物对植物病原真菌的抑制活性最好，乙酸乙酯部位次之，乙醇部位提取物的抑菌活性明显低于其他前两个部位(图1)。香樟石油醚提取物对油菜菌核菌(S-1)、瓜果腐霉菌(P-3)、茄链格孢病菌(A-2)的抑制率分别为78.08%、70.37%、77.10%，具有较好的抑菌活性；香樟乙酸乙酯提取物对5种植物病原真菌的抑菌率均高于30%，对茄链格孢病菌(A-2)的抑菌效果最好，为57.94%；香樟乙醇提取物对瓜果腐霉菌(P-3)和茄病镰刀病菌(F-4)的抑菌效果最好，抑制率为52.38%和35.52%，对其它3种植物病原菌存在一定抑制效果，但效果不如乙酸乙酯部位和石油醚部位的提取物。

图1 香樟3个部位提取物抑菌率

2.2 香樟乙酸乙酯提取物对病原菌的毒力测定结果

选取瓜果腐霉菌(P-3)和茄链格孢菌(A-2)进行毒力测定，拟合相应的毒力回归方程(表1)。香樟乙酸乙酯提取物对茄链格孢菌的抑制效果最佳，EC50值为1.806 0 mg/mL；对瓜果腐霉菌的抑制作用较低，EC50值为1.935 0 mg/mL(图2)。

表1 香樟乙酸乙酯提取物对2种植物病原菌的相对毒力

图2 不同浓度香樟乙酸乙酯提取物对2种植物病原菌的抑制效果

3 讨论与结论

本研究通过活性追踪法，研究了香樟3个部位提取物对5种植物病原真菌的抑菌活性，旨在为活体筛选抑菌植物提供依据。试验结果表明香樟提取物对茄病镰刀病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核菌、瓜果腐霉菌、茄链格孢菌具有抑制作用，且不同提取溶剂提取的有效成分对植物抑菌效果不尽相同。香樟石油醚提取物与乙酸乙酯提取物抑制作用效果明显，抑制活性高于乙醇提取物。在2 mg/mL浓度条件下，石油醚提取物对油菜菌核菌、瓜果腐霉菌、茄链格孢病菌的抑制率均在70%以上，具有较好的抑制作用，具备开发为防治多种植物病害的天然药物的潜力。结合回归分析数据，香樟乙酸乙酯对茄链格孢菌的抑菌活性最好，EC50值为1.806 0 mg/mL，可作为一种防治茄链格孢菌的新型植物源杀菌剂进一步研究。

香樟是一种兼具材用、药用的植物，在我国资源较为丰富。香樟叶提取完精油后的提取液作为废弃物排放，势必会对环境造成一定的污染，所以发现其潜在抑菌活性成分就显得尤为重要。植物源杀菌剂研究的基础是植物源抑菌活性物质的分离鉴定。抑菌活性成分的分离鉴定对于解释其杀菌活性机理和开发应用为植物源杀菌剂等具有至关重要的意义[18]。本研究发现香樟提取物的抑菌活性成分集中于石油醚提取部位，今后可围绕香樟石油醚提取部位进行抑菌先导化合物的开发，为香樟叶及其他部位资源的研究与开发利用奠定基础，也为开发新型植物源杀菌剂开发提供依据。