黑色素瘤缺乏因子2在结直肠癌中的表达及临床意义

陈建军 王振军 赵宝成 李竹林

黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)作为组成炎症小体的一种关键蛋白，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。编码AIM2的基因位于1q21，在恶性黑色素瘤中作为一种抑癌基因[1]。有研究指出，在多种实体肿瘤中AIM2的表达存在差异[2-6]。Dihlmann 等[7]通过组织芯片(TMA)技术分析了414例国外结直肠癌病人的肿瘤组织和癌旁组织，结果显示肿瘤组织与癌旁组织相比AIM2基因表达降低。但Liu等[8]使用QRT-PCR技术研究了40例中国病人，他们发现结直肠癌病人的肿瘤组织与癌旁组织中AIM2的表达无明显差异。我们使用荧光定量PCR和免疫组化技术来明确结直肠癌组织中AIM2的表达水平，分析AIM2的蛋白水平与结直肠癌病人的临床病理特征之间是否存在相关性。

对象与方法

一、对象

2015年6月～2016年6月间我院经手术治疗的原发性结直肠癌病人标本，其中包括64例新鲜冰冻组织标本，68例石蜡标本。入组条件：(1)均为原发性结直肠癌病人；(2)术前未接受放、化疗及其他新辅助治疗；(3)具有完整的临床病理结果；(4)标本采集均通过首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会鉴定同意。分别留取病人肿瘤组织及距肿瘤组织3～5 cm处的癌旁组织标本。

二、方法

1.荧光定量PCR验证AIM2的表达：新鲜冰冻样品进行研磨裂解后，提取RNA并进行逆转录，采用的内参基因为GAPDH，目的基因AIM2的上游引物序列为GCAAGATATTATCGGCACAG，下游引物序列为GAGTTTGAAGCGTGTTGATC，荧光定量PCR的结果采用相对定量法2-ΔΔCt进行分析。

2.免疫组化：将固定后的组织石蜡包埋、4 μm厚连续切片，经过抗原修复、清除内源性过氧化物酶、血清封闭后，采用1∶500浓度的Anti-AIM2抗体进行一抗孵育，后滴加酶标抗鼠/兔聚合物，并通过DAB显色及复染后完成免疫组织化学染色。使用免疫反应评分(imunoreactivity sore,IRS)来进行半定量分析AIM2蛋白的表达水平。AIM2免疫组化阳性信号定位于细胞浆和/或细胞核着色呈棕黄色。着色细胞数评分按AIM2阳性细胞百分率计算，阳性细胞1%～10%记为1分，11%～50%记为2分，51%～80%记为3分，81%～100%记为4分。表达强度则以阴性记为0分，弱阳性记为1分，阳性记为2分，强阳性记为3分，着色细胞数得分乘以着色强度得分为最终得分。随机选择5个高倍镜(×400)视野进行计数，每个视野计数 100个细胞。

三、统计学方法

应用SPSS 19.0软件分析数据。结直肠癌组织及其癌旁组织AIM2的mRNA水平的相对表达的差异采用配对样本t检验；蛋白水平的差异采用t检验；AIM2免疫染色评分水平与其他临床病理因素的相关性分析及其他计数资料用多因素方差分析。P<0.05为差异具统计学意义。

结果

荧光定量PCR提示结直肠癌肿瘤组织中AIM2的mRNA水平降低。荧光定量PCR结果显示，在64例肿瘤组织标本中，AIM2相对表达水平2-ΔΔCt为0.65±0.62，而癌旁组织的2-ΔΔCt为3.19±3.13。结直肠癌肿瘤组织中AIM2的mRNA表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织中AIM2表达水平比较(aP<0.05)

68例石蜡标本的免疫组化的结果显示，AIM2蛋白在结直肠癌肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织。AIM2蛋白主要位于细胞质中，阳性染色为棕黄色或褐色(图2)。综合考虑免疫反应评分及染色阳性率来判定AIM2的表达情况，68例结直肠癌组织中，免疫反应评分为4.53±3.43，染色阳性表达率为75.00%(51/68)；癌旁组织的免疫反应评分为7.76±3.38，染色阳性表达率为95.59%(65/68)，免疫反应评分及染色阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果提示，结直肠癌肿瘤组织中的AIM2蛋白表达水平要低于癌旁组织，这与荧光定量PCR的结果相符合。

A：AIM2阳性表达(HE，×200)；B：AIM2阴性表达(HE，×200)

研究的临床指标包括病人的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度、T分期、淋巴结转移、远处 转移及TNM分期。结果显示，AIM2的蛋白水平与结直肠癌的分化程度显著相关(P<0.05)，即肿瘤分化越差时AIM2蛋白的表达水平越低，而与其他临床指标未见明显相关性(P>0.05)。见表1。

表1 结直肠癌组织中AIM2的蛋白水平与各临床病理特征的关系

讨论

结直肠癌是严重危害人类健康的常见消化系统恶性肿瘤，2020年美国有147 950例新发病例，在男性和女性肿瘤中均排在第3位[9]。有数据显示，在中国人群中，结直肠癌的发病率及死亡率也处于较高水平[10]。由于病人的早期症状不明显，没有早期诊断的特异性标志物，很多病人确诊时已发生局部或远处转移，结直肠癌治疗后5年生存率为50%～60%。寻找合适的标志物，有助于早期发现结直肠癌并明确高风险的病人。

AIM2是一种潜在的肿瘤标志物，在多种肿瘤组织中存在表达异常。AIM2蛋白属于干扰素诱导的PYHIN蛋白家族(或称为p200蛋白家族)的一员[11],作为固有免疫中的一个重要组成部分，AIM2在多种细胞中存在表达，在多种皮肤疾病的角质细胞中可观察到固有免疫细胞中外源性双链DNA通过AIM2激活炎性小体[12]。除了固有免疫细胞，有研究证实了血管内皮细胞和平滑肌细胞中的AIM2也可感受外源性双链DNA，而在脾脏、小肠、外周血白细胞中也发现有AIM2的mRNA表达。提示在多种细胞中，AIM2是普遍的危险感应器。在肿瘤组织中，AIM2的表达会发生异常改变，研究指出在前列腺癌组织，胶质瘤组织中AIM2的表达减少[13-14]，而在皮肤鳞状细胞癌和肺腺癌中AIM2的表达会增加[4，15]，提示在不同的肿瘤组织中，AIM2发挥的作用也存在差异。目前，国内外报道中关于AIM2在结直肠癌中的表达水平存在矛盾。

本研究通过荧光定量PCR和免疫组化技术分别检测了64例结直肠癌病人的新鲜冰冻组织标本和68例石蜡标本及对应的癌旁组织标本，结果显示，结直肠癌组织中的AIM2的mRNA水平和蛋白水平均低于相应的癌旁组织，此结果与Dihlmann等[7]结果相一致。

为了进一步了解AIM2与结直肠癌病人不同临床病理特征之间是否存在联系，我们对肿瘤组织中AIM2的蛋白水平与病人的临床病理参数进行了分析。结果显示，AIM2的表达水平与肿瘤的分化程度有关，肿瘤分化程度越低，AIM2蛋白水平越低。肿瘤分化程度是影响肿瘤病人生存期及预后的重要因素，因此AIM2蛋白的表达情况可能是结直肠癌重要的预后预测因子，而其相关机制仍需要进一步研究。