新疆哈萨克族原发性高血压患者人巨细胞病毒流行基因型及变异分析

唐娜,钟华,王腊梅,席冬梅,何芳

(石河子大学医学院,新疆 石河子 832000)

高血压是导致心血管并发症的一种常见病、多发病,目前已成为最严重的公共卫生问题,大约95%的高血压为原发性高血压(essential hypertension,EH)。迄今为止,EH的确切病因与发病机制仍未阐明。近年来,人们发现其致病因素不仅与遗传和环境因素互作有关,还与人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus,HCMV)感染有着密切的联系:HCMV感染人体后可引起潜伏性感染和产毒性感染,以前者为主,而在机体抵抗力下降时可被激活,形成产毒性感染,引起明显的临床症状,与心血管病、动脉粥样硬化、高血压等疾病具有很大的相关性[1-3]。

HCMV是一种具有高度传染性和流行的双链DNA病毒。流行病学调查显示全球范围内HCMV感染率为40%～100%[4],是一种普遍感染的病原体。其膜糖蛋白有gB、gH等,结构蛋白包括pp 65、pp 150等。其中,gB拥有很强的免疫原性,在促进HCMV侵入细胞或在细胞之间传播及感染细胞的融合中起重要作用。根据gB基因密码子446-523区域核苷酸差异,可将HCMV分为gB1、gB2、gB3和gB4型4种亚型[5],不同种族易感gB亚型及不同疾病gB亚型分布特征不尽相同,gB基因型之间的差异可能影响其发病机制[6-7]。位于新疆地区的哈萨克族是代表新疆维吾尔自治区的主要少数民族群体之一,流行病学调查发现,新疆哈萨克族人口的平均血压和高血压患病率明显高于居住在同一地区的其他民族人口[8]。此外,我们先前的研究表明,HCMV与新疆哈萨克族EH有关[9]。因此确定gB基因型在新疆哈萨克族EH患者中的多态性及变异情况是本研究的目的。

1 资料与方法

1.1 研究对象来源

选择2009年11月至2012年5月,在新疆天山北麓塔城地区沙湾县多个牧区及村镇,14次流行病学共调查并采集隔夜空腹血(10 mL)全血样本2 300例(离心,分离,冷冻,包装在-80 ℃冷柜)。随机选取哈萨克族800名(其中EH组467例,按照匹配原则抽取正常对照组333例)。抽提样本外周血白细胞DNA并应用实时荧光定量PCR检测外周血白细胞中HCMV-DNA。收集外周血白细胞中HCMV-DNA阳性者107例(高血压患者70例、健康对照组37例)作为研究对象。

1.2 病例组与对照组诊断纳入标准

1)病例组的选择:按照中国高血压防治指南。在未用抗高血压药的情况下,非同日测量3次,收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg,可诊断为高血压;患者既往有高血压史,目前正在服用抗高血压药,血压虽低于140/90 mmHg,也应诊断为高血压。2)对照组纳入标准:收缩压＜140 mmHg和舒张压＜90 mmHg,无服用降压药史及其它器质性心脏病史的健康人群。3)排除标准:继发性高血压:如原发性醛固酮增多症、嗜铬细胞瘤等;排除对HCMV血清学测定有影响的疾病或服用影响实验的药物;有器官移植病史、自身免疫功能缺陷或长期口服免疫抑制剂及HIV感染等;近4周患有急性感染或疾病以及近2周内应用抗生素及抗病毒药物者。

1.3 提取外周血白细胞DNA

采用苯酚-氯仿法提取DNA(300 μL全血样本),经核酸蛋白分析仪进行纯度和浓度及琼脂糖电泳鉴定检测后于-20 ℃保存备用。用于检测HCMV-DNA。

1.4 实时荧光定量PCR诊断HCMV-DNA阳性

使用HCMV核酸定量检测试剂盒检测外周血HCMV-DNA(中山大学达安基因公司,中国)。使用ABI Prism 7300自动荧光PCR仪进行扩增。结果判定:1)模板最初拷贝数的对数与其循环阈值(Cycle threshold,CT)存在线性关系。2)检测样本CT＜30且呈典型的S型曲线时为阳性。3)检测样本Ct≥30为阴性。

1.5 HCMV gB基因型检测

1.5.1 巢式PCR

应用巢式PCR扩增HCMV gB基因型[5]。引物序列如表1所示。

表1 巢式PCR引物序列

1.5.2 限制性片段长度多态性分析(RFLP)

以巢式PCR内侧扩增产物为模板,分别用限制性核酸内切酶Rsa I和Hinf I进行酶切,酶切体系为20 μL,12 h(37 ℃)。酶切产物加样至2.5%琼脂糖凝胶,使用电泳检测(100 V,25 min),置凝胶成像仪中观察结果。参照文献[10],根据酶切片段不同鉴定和分型。gB1型305 bp:Hinf I酶切片段为:202、67,36 bp、Rsa I酶切片段为:239、66 bp;gB2型(302 bp):Hinf I酶切片段为:202,100(bp),Rsa I酶切片段为:239、63 bp;gB3型299 bp:Hinf I酶切片段为:202、97 bp,Rsa I酶切片段为:195、63、41 bp;gB4型305 bp:Hinf I酶切片段为:202、69、36 bp,Rsa I酶切片段为:195、66、44 bp。

1.5.3 HCMV gB扩增产物测序及序列分析

对巢式PCR内侧扩增产物进行测序(北京博迈德基因技术有限公司)。并使用DNAMAN、Clustal X及MEGA 6软件进行序列分析。各个型别的HCMV标准病毒株核苷酸序列下载自GenBank。

1.6 统计分析

采用SPSS软件进行数据分析。主要采用χ2检验、方差分析等。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新疆地区哈萨克族HCMV-DNA阳性受试者一般情况

在107例阳性样本中,HCMV-DNA阳性中EH组患者平均年龄50.7,显著高于对照组43.1(t=4.889,P＜0.05)(表2)。HCMV-DNA阳性EH患者中男性48.6% (34/70),女性51.4%(36/70);对照组男性32.4%(12/37),女性67.6%(25/37),EH组与对照组在性别比例无统计学差异(χ2=2.572,P＞0.05)。HCMV-DNA阳性的EH患者占65.4%(70/107)显著高于对照组34.6% (37/107) (χ2=10.178,P＜0.05)(表2)。

表2 HCMV-DNA阳性与阴性临床相关指标比较

2.2 新疆地区哈萨克族HCMV gB基因型分布及构成比

哈萨克族共107例,单一gB基因型:gB2型占37.4% (40/107),在新疆哈萨克族人群中尚未发现gB1,gB3和gB4型。

此外,实验中还发现gB混合基因型:gB1+2型和gB2+3型。gB混合基因型占62.6% (67/107),其中gB1+2基因型占47.6% (51/107),gB2+3型占15.0% (16/107)。这3种基因型:gB2型、 gB1+2和gB2+3型的构成比存在差异(χ2=17.961,P＜0.05),(表3,图1a、b)男性共46例:gB2型占39.1% (18/46);gB1+2基因型占47.8% (22/46),gB2+3型占13.1% (6/46)。女性共61例:gB2型占36.1% (22/61):gB1+2型占47.5% (29/61);gB2+3型占16.4% (10/61)。对哈萨克族男性、女性中HCMV gB基因型的分布及构成比进行统计学分析,结果无统计学差异(χ2=0.263,P＞0.05)(表3,图1c)。

表3 哈萨克族男性和女性HCMV gB基因型的分布及构成比

图1 哈萨克族HCMV感染者gB基因型分布(n=107)

2.3 新疆地区哈萨克族EH患者中HCMV gB基因型分布及构成比

结果显示,新疆哈萨克族EH患者中存在一种单一gB基因型gB2型,尚未发现gB1、gB3和gB4型;发现gB混合基因型两种:gB1+2型,gB2+3型。其中gB2型占37.1% (26/70),gB1+2型占48.6%(34/70),gB2+3型占14.3%(10/70)。

这3种基因型:gB2型、gB1+2型和gB2+3型在EH患者中的分布及构成比有差异(χ2=12.800,P＜0.05)和图1d;在EH男性:gB2型占47.1% (16/34),gB1+2型占47.1% (16/34),gB2+3型占5.8%(2/34)。在EH女性中:gB2型占27.8% (10/36),gB1+2型占50.0% (18/36),gB2+3型占22.2%(8/36)。EH男性、女性中各HCMV gB基因型的分布及构成比统计学分析不存在差异(χ2=5.049,P＞0.05)(表4、图1e)。

表4 哈萨克族EH患者中男性和女性HCMV gB基因型的分布及构成比

2.4 HCMV gB扩增产物测序及序列分析

对107份阳性样本命名:XJKZ-1到XJKZ-107,从107份HCMV gB扩增产物中按照相同构成比对64份扩增产物进行测序,包括单一gB基因型23例,混合gB基因型41例。由于混合gB基因型Genbank中没有相对应的标准株,因此序列分析时均以单一gB基因型(gB2)作为研究对象。各单一基因型:gB2型阳性样本的测序结果及核苷酸序列见图2。

图2 gB2基因序列比较(n=23)

2.5 各单一gB基因核苷酸以及氨基酸突变位点

使用MEGA 6.0软件中的ClustalW将实验得到的23例样本的gB片段与GenBank中的标准病毒株(gB2:M60932)进行多序列比对,结果如图2a所示。其中核苷酸变异位点主要集中在1389-1450位,变异较多的XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65在该区段的变异率分别是:8.2%,4.9%,8.2%,1.6%,11.5%。氨基酸位点的主要变异集中在513-574位如图2b所示。整个区段的前段变异较多,而后半部分的保守性很高,应该在gB蛋白发挥功能的过程中发挥重要作用,可能是gB蛋白的重要结构域。其中XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65在该区段的变异位点(变异率)分别是:5(8.2%),3(4.9%),8(13.1%),3(4.9%),6(9.8%)。其中515位上有两个阳性病毒株由天冬氨酸→谷氨酸,467位上4个阳性株由苏氨酸→丙氨酸,479位上有3个阳性病毒株由缬氨酸→甘氨酸,520位上3个阳性病毒株由丝氨酸→异亮氨酸,值得注意的是,在473位上有三个阳性株发生终止密码子变异。

2.6 各单一gB基因片段与不同型别的标准病毒株的系统发育分析

对四个不同型别的标准病毒株[M60927(gB1),M60932(gB2),M60933(gB3),M60924(gB4)]和本研究扩展得到的基因片段使用MEGA6.0软件进行系统发育分析,其结果如图3所示。图中我们可以看出,23个病毒株均与gB2标准病毒株的亲缘关系较近,而与gB1,gB3,gB4等3个标准病毒株亲缘关系较远,并未在同一分支上发生聚集。这一结果也与我们前面基因型鉴定实验得到的结果相一致。同时结果显示,XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65虽然与gB2亲缘关系较近,但是并未与标准菌株在同一分支上发生聚集,说明这5个病毒株的变异可能对病毒的功能产生影响。

图3 HCMV基因组gB段的系统进化树分析(n=23)

3 讨论

本次研究首次针对新疆哈萨克族高血压患者人群HCMV感染的易感基因型及变异进行分析。实验发现在新疆哈萨克族高血压人群中混合基因型gB1+2与单一gB 基因型gB2为易感基因型。我们发现哈萨克族群体中单一基因型gB2型序列存在差异:核苷酸突变率为8.2%～11.5%、氨基酸突变率为4.9%～13.1%。本研究通过分析哈萨克族人群以及EH患者感染gB基因型的分布特点,为阐明新疆地区哈萨克族及EH患者HCMV感染流行株的分子流行病学特征提供了线索。

大量文献证明,gB基因型多态性在HCMV感染中普遍存在。一项关于113名健康HCMV阳性的非裔美国妇女的流行病学调查中,发现该人群中存在单一和混合的gB基因型感染,gB2型是最常见的,其次是gB4型[10]。MADHAVAN等人[11]发现儿童HCMV感染主要以gB2为主。在美国青少年HCMV感染中易感基因型为gB1为主[7]。在亚洲地区,泰国人混合基因型为gB2+3多见,常见单一基因型为gB1[6],而本实验发现同为亚洲人,新疆哈萨克民族多见混合基因型为gB1+2,其次为单一基因型gB2型。这表明HCMV基因型分布受地域环境和种族的影响。许多研究表明,HCMV gB混合基因型最常见的组合是gB2+3或gB1+3型[12-13]。这可能是由于不同HCMV gB基因型的再感染和/或由于潜在HCMV感染的再激活是上述人群中的常见特征。从而导致重组和形成新的HCMV变异体的机会增加[14]。

鉴于gB在病毒-宿主相互作用中的重要作用,多项研究表明,HCMV gB基因型在不同疾病的人群:同种异体移植受者、慢性牙周炎患者和先天性感染婴儿中也存在多样性[15-17]:在移植患者中,gB1型是最常见的基因型。慢性牙周炎患者中,gB2型是最常见的基因型。先天性感染HCMV基因型的报道在不同地区和国家分布不同:gB1型在匈牙利南部的先天性感染中占主导地位[11],而印度则以gB2和gB3型为主[6]。而我们的研究显示在新疆哈萨克族人群及EH患者中HCMV感染的易感基因为混合基因型gB1+2型,其次为单一基因型gB2。这种差异可能是由于病毒株地理分布的差异,或由于种族和疾病谱的差异导致的。

为了确定HCMV gB是否含有多态性,特别是基因型内变异,我们对23个单一基因型:gB2基因型中进行DNA测序。gB2型内HCMV株之间的序列同源性为88.5%～100%,这与以往关于每个基因型内临床菌株同源性为98.6%～99.9%的报道不同[5]。同时我们发现有5个gB2基因型变异样本(XJKZ-19、48、58、62、65)在核苷酸其样本变异率高达11.5%,氨基酸变异率高达13.1%,值得注意的是,在473位上有3个阳性株发生终止密码子变异,将对整个蛋白的功能产生较大的影响。在系统发育树中,我们还发现这些样本中核苷酸变异的百分比超过1%,表明再次感染是诱导基因型内变异的常见机制。在我们的研究中,所有的基因型内变异都发现在5个EH患者样本中。众所周知,HCMV的重新激活可能随时发生,特别是在免疫功能低下的宿主,如EH患者,可能导致核苷酸变异增加。由于gB在诱导中和抗体中起着重要作用,gB分子的构象变化可能是逃避免疫反应的机制之一。因此,本研究EH患者的基因型内变异可能是由与其他病毒相似的宿主免疫的阳性选择引起的[[18-19]。

总之,本研究明确了新疆地区哈萨克族人群及高血压患者HCMV流行株gB基因型的分布,我们发现新疆哈萨克族人群及高血压患者中易感基因型为gB1+2和gB2型。同时新疆哈萨克族人群中单一基因型:gB2型在核酸及氨基酸存在变异。基于目前文献报道HCMV感染与高血压的密切关系,无疑本研究结论将为进一步阐明HCMV在高血压发病中作用和机制提供重要理论基础,并为其防治提供新靶标。