不同处理对牛枝子种子萌发和宿存萼片的影响

马鹏程， 谢全刚， 赵 祥， 董其军， 张吉宇*

(1.草地农业生态系统国家重点实验室； 兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020； 2. 河西学院农业与生态工程学院，甘肃 张掖 734000； 3. 山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801； 4. 酒泉市未来草业有限责任公司， 甘肃 酒泉 735000)

牛枝子(LespedezapotaniniiVass.)为豆科胡枝子属多年生牧草，生长于荒漠草原、草原带的沙质地、砾质地、丘陵地、石质山坡及山麓[1-2]。自2003年起，兰州大学草地农业科技学院在内蒙古阿拉善盟，发现豆科牛枝子作为少有的优良牧草，在年降水量为120 mm的荒漠草原生长良好，因而开展了驯化选育，以产量性状和抗旱性为选育目标，在内蒙古阿拉善盟和甘肃榆中经过连续多年的栽培驯化[3]，2021年经甘肃省草品种审定委员会审定为新品种‘腾格里’牛枝子(审定编号：GS-CWV-2020-007)，该品种具有抗旱、抗寒和耐瘠薄的特点，适宜于我国北方干旱半干旱、年降雨量为100～400 mm的地区和黄土高原半农半牧区，为荒漠草原补播、干旱地区植被恢复、人工草地建植的优良豆科牧草。‘腾格里’牛枝子可与‘腾格里’无芒隐子草(Cleistogenessongorica)混播，构建荒漠草原、沙漠化防治与治理的乡土草种“禾本科+豆科”混播生态系统，为脆弱生态区提高生产力和生态服务功能提供案例。但是由于牛枝子种子紧紧包裹于宿存萼片中，并且种子硬实率很高，致使种子脱粒难度大和田间出苗率差，严重制约了该品种的规模化生产和推广利用。

硬实是植物中普遍存在的现象，硬实种子是由于种皮(有时也包括果皮)坚硬而很难进行吸胀萌发的种子，广泛存在于豆科、茄科、旋花科、锦葵科等多种植物中[4-5]。硬实有利也有弊，一方面有利于抵抗逆境、收获和贮藏，另一方面不利于建植与杂草防治和种子检验与加工[6-7]。但在农业生产中，有效的破除硬实，促进种子萌发，对于成功建植至关重要[8]。大量研究表明，牧草硬实种子可以通过物理处理方法和化学处理方法有效的破除，如紫花苜蓿(Medicagosativa)、达乌里胡枝子(Lespedezadavurica)、鸡峰黄芪(Astragaluskifonsanicus)和黄芪(Astragalusmembranaceus)等种子可以用不同的方法破除硬实[9-14]。种子收获是决定种子生产成败的关键环节，而种子的脱粒是种子收获的主要内容之一[15]。有研究表明，苜蓿和三叶草(Trifolium)等豆科牧草可以采用木刀种子脱粒机进行脱粒，对种子的损伤小，种子质量较好[16]。牛枝子种子硬实率高达96.00%左右，且宿存萼片在种子成熟后不会自然脱落，会紧紧附着在种子表面，这给种子萌发和脱粒带来困难，针对这种特性，实际生产中应重点解决脱粒和硬实破除的技术问题。但对于牛枝子种子硬实破除和脱粒的研究鲜有报道。因此，本研究通过研究不同处理对牛枝子宿存萼片和种子硬实的影响，旨在明确牛枝子去除宿存萼片和破除硬实的方法，为‘腾格里’牛枝子的推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料为于2020年10月在甘肃张掖甘州区收获的兰州大学所培育的‘腾格里’牛枝子种子。

1.2 试验设计

1.2.1宿存萼片去除 浓硫酸处理：将100粒带有宿存萼片种子分别置于盛有10 mL 98%的浓硫酸中，用玻璃棒小心搅拌使种子完全浸没，分别处理0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 min，取出后自来水冲洗3 min，每个处理重复3次。

种子破皮机处理：将100粒带有宿存萼片种子用种子破皮机进行处理1～10遍，每个处理重复3次。

1.2.2硬实破除 种子破皮机处理：用种子破皮机(湖南农友机械有限公司，6 NF-4振动筛单米机改造而来)处理一定量去除宿存萼片种子1～10遍，每个处理重复3次，对照(CK)为不做任何处理，下同。

浓硫酸处理：将一定量去除宿存萼片种子分别置于盛有10 mL 98%的浓硫酸中，用玻璃棒小心搅拌使种子完全浸没，分别处理0，5，10，15，20，25，30 min，取出后自来水冲洗3 min。

热水处理：分别用70，80，90，97℃(沸水)热水处理一定量去除宿存萼片种子至水自然冷却，将种子取出备用。

高温处理：将一定量去除宿存萼片种子放在80，90，100℃恒温干燥箱中分别处理0.5，1.0，1.5，2.0 h。

液氮处理：用液氮处理一定量去除宿存萼片种子3，5，10 min。

1.2.3发芽试验 参考国家标准《草种子检验规程发芽试验》(GB/T 2930.4-2017)[17]，将处理后的种子各取100粒，用培养皿纸上发芽的方法(TP法)，于25℃下进行发芽，光照/黑暗为12 h/12 h，发芽天数为14 d，设置3个重复，滤纸为90 mm定性滤纸，第7 d计算发芽势，14 d计算发芽率。

1.3 测定指标及方法

根据记录的经过种子破皮机处理后去除宿存萼片数、破碎数、种子发芽数、幼苗鲜重，计算牛枝子宿存萼片去除率、种子破碎率、发芽率、发芽势、发芽指数与活力指数等指标，采用以下公式进行计算[18-19]：

宿存萼片去除率=去除宿存萼片完整的种子数/供试种子数×100%

破碎率=破碎种子数/供试种子数×100%

发芽势=第5 d正常发芽种子数/供试种子数×100%

发芽率=第14 d正常发芽种子数/供试种子数×100%

发芽指数=Σ(Gt/Dt)

活力指数=Σ(Gt/Dt)×S

式中：Gt为不同时间的发芽数，Dt为相应发芽日数，S为第10 d每株平均鲜重。

1.4 数据分析

数据统计和制图分别由Microsoft Excel 2010完成，并用IBM SPSS statistics19.0进行单因素试验方差分析，并用LSD法对各项指标进行多重比较(P< 0.05)，数据均以“均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 种子破皮机和浓硫酸对牛枝子宿存萼片去除的影响

种子破皮机处理对牛枝子宿存萼片去除具有显著影响(P<0.05)(图1a)。随着种子破皮机处理遍数的增加，宿存萼片的去除率先升高后不变，在处理第4遍时去除率达到100%。浓硫酸处理对牛枝子宿存萼片的去除也具有显著影响(P<0.05)(图1b)。随着浓硫酸处理时间的增加，宿存萼片的去除率先升高后不变，在12 min及之后处理去除率均达到100%。

图1 种子破皮机和浓硫酸处理对牛枝子宿存萼片的影响Fig.1 Effect of the seed coat breaking machine and concentrated sulfuric acid treatments on the persistent sepals of Lespedeza potaninii Vass注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。A为种子破皮机处理；B为浓硫酸处理Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level,the same as below. A,the seed coat breaking machine treatments;B,concentrated sulfuric acid treatments

2.2 种子破皮机对牛枝子发芽的影响

种子破皮机对牛枝子种子发芽具有显著影响(P<0.05)(表1)。种子破皮机处理过程中，种子会存在破碎的现象，随着处理遍数的增加，破碎率一直增大，在10遍时最大，为8.00%，与8和9遍无显著差异；硬实率随处理遍数增加显著下降(P<0.05)，在10遍时最小(24.33%)，与CK(96.67%)差异显著(P<0.05)，与9遍时无显著差异；发芽势、发芽率和发芽指数随处理遍数增加呈先升高后下降趋势，均在9遍时达到最大，分别为61.67%，66.33%和33.14；活力指数也呈先升高后下降趋势，在处理8遍最大，为0.87，并与9遍时无显著差异。结果表明种子破皮机对打破牛枝子种子休眠和萌发具有较好的效果，并在处理9遍时效果最佳。

表1 种子破皮机处理对牛枝子种子发芽的影响Table 1 Effects of different the seed coat breaking machine treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.3 浓硫酸处理对牛枝子种子发芽的影响

浓硫酸处理对牛枝子种子的发芽具有显著影响(P<0.05)(表2)。牛枝子种子硬实率非常高，浓硫酸处理显著降低硬实率(P<0.05)，处理30 min时硬实率最低(13.33%)。随着浓硫酸处理时间增加，发芽势和发芽率呈增大趋势，在30 min时达到最大，分别为80.00%和84.00%，并与20 min和25 min处理无显著差异；发芽指数呈增大趋势，在30 min时最大，为38.73，与20 min处理无显著差异；活力指数呈先升高后下降的趋势，在25 min时最大，为1.14，与20 min和30 min无显著差异。结果表明，浓硫酸处理可以有效的破除牛枝子种子硬实，提高发芽率和发芽势等，处理20～30 min均可。

表2 浓硫酸处理对牛枝子种子发芽的影响Table 2 Effects of sulfuric acid treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.4 高温干燥处理对牛枝子种子发芽的影响

高温干燥处理对牛枝子种子发芽有一定的影响(表3)。80℃和90℃处理对牛枝子种子硬实破除和促进发芽的效果不明显。在100℃时，随着处理时间增加，硬实率呈一直下降的趋势，在100℃处理2 h时硬实率最低，为36.00%，与CK差异显著(P<0.05)；发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均呈先升高后下降的趋势，在100℃处理1.5 h时均达到最大值，分别为32.67%，35.33%，21.75和0.47。

表3 高温干燥处理对牛枝子种子发芽的影响Table 3 Effects of high temperature treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.5 热水和液氮处理对牛枝子种子发芽的影响

热水和液氮处理对牛枝子种子发芽具有一定的影响(表4，5)。随着水温度的升高，硬实率呈下降趋势，在97℃处理时硬实率最低，与CK差异显著(P<0.05)；发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均先上升后下降，在90℃的热水处理下均达到最大值，分别是22.67%，38.00%，12.19和0.42。相比CK，液氮处理显著降低了牛枝子硬实率，提高了发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数(P<0.05)，但发芽率最高仅16.67%，且处理时间对硬实破除效果没有显著影响。

表4 不同热水处理对牛枝子种子发芽的影响Table 4 Effects of different hot water treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

表5 不同液氮处理对牛枝子种子发芽的影响Table 5 Effects of different liquid nitrogen treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

3 讨论

3.1 不同的处理对去除牛枝子宿存萼片的影响

牛枝子的宿存萼片在种子成熟时不会自然脱落，附着在种子表面，给种子脱粒带来困难。本研究研究表明，种子破皮机对牛枝子宿存萼片去除效果显著，在处理4遍时，去除率可达到100%。这与余殿友[20]研究结果一致，胡枝子(LespedezabicolorTurcz)种子可以采用种子破皮机去除宿存萼片，同时也可将种子打磨以便降低硬实率，提高种子的发芽率。浓硫酸虽然对于牛枝子宿存萼片去除具有显著效果，但在大规模的生产中具有一定的危险性，不宜采用，种子破皮机相对比较安全且经济，所以在生产过程宜采用种子破皮机去除宿存萼片。

3.2 不同的处理对牛枝子萌发的影响

打破种子硬实的方法很多，但是对于不同的物种，各种方法处理效果不尽相同。机械破除硬实更容易实现商业化[21]，且更为有效和安全；机械处理通过损伤硬实种皮，增强透性，迅速解除机械限制作用而促使种子萌发[22]。牛枝子作为一种抗旱优良豆科牧草，在畜牧业和生态恢复方面发挥着重要作用，但种子硬实率高达96.00%左右，若不能解决牛枝子种子硬实问题，则无法推广种植，因此急需一种安全经济的牛枝子种子硬实破除技术。许多研究表明，机械法可以有效破除田菁(Sesbaniacannabina)、紫云英(AstragaluscicerL.)、草木樨状黄芪种子(Astragalusmelilotoides)和野豌豆(ViciaamoeaFisch)等种子硬实，提高发芽率等，可以作为破除硬实的首选方法[23-26]。这与本研究试验结果一致，种子破皮机处理牛枝子种子可以显著降低牛枝子的硬实率，从96.67%降低至24.33%；发芽率从2.67%提高到66.33%；并且提高了发芽势、发芽指数和活力指数，在处理9遍时效果最佳；而且本研究创新性使用种子破皮机不仅大幅降低牛枝子种子硬实率，发芽率也超过60.00%，还可以有效的去除宿存萼片，且操作简单安全，可在生产实践中推广，这为‘腾格里’牛枝子种子扩繁和推广奠定了基础。

浓硫酸等强酸处理可以腐蚀局部种皮，打破栅栏组织的屏障，使种壳薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大种皮的透性[27]。浓硫酸对大多数种子硬实破除是最有效的方法，但是也存在一些问题：如处理时间的较难控制，特别是对于种皮较薄的种子，如果处理时间过长，就会损伤种子；处理后的冲洗要彻底，不然易造成酸害等[22]。有研究表明，浓硫酸可以降低紫花苜蓿、黄芪、达乌里胡枝子、多花木蓝(Indigoferaamblyantha)、二色胡枝子(Lespedezabicolor)和山野豌豆等种子硬实率，提高发芽率，并在所有处理效果最佳[28-32]。与本试验的结果表明相似，浓硫酸浸种20～30 min发芽率均最高，都在80%以上，硬实率大大降低，在所有处理中效果最佳，但浓硫酸是严格控制使用的化学药品，在使用过程中操作不当会造成严重的后果，所以在大规模生产过程中一般不建议用浓硫酸破除硬实。

高温处理可用高温干燥处理和温水浸泡处理。某些牧草种子经过高温干燥处理后，种皮龟裂为疏松多缝的状态，改善了种子的气体交换条件，从而解除由种皮造成的休眠，促进萌发[22]。有研究表明，将银合欢(Leucaenaleucocephala)用80℃高温干燥10 min，发芽率效果较差，仅为19.3%[33]；本研究结果表明，高温干燥处理，温度过低和时间较短时，硬实破除效果不佳，但温度过高和时间较长，虽硬实率降至36.00%，但发芽率最高也仅为32.37%，导致这种现象的原因是处理温度过高和时间过长会导致种子的死亡，从而导致发芽率较低。但也有研究表明，高温干燥处理可以有效降低黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)和无芒隐子草等种子硬实率，提高发芽率[34-35]。这说明不同物种高温干燥处理的效果不同，应根据物种进行选择。Wang等[36-37]用热水处理5种野生豇豆(Vigna)，研究表明80℃热水浸种是适宜的浸种温度，温度过低破除休眠效果较差，而温度过高会伤害种子使不正常和死种子增加，适宜浸种时间为3～6 min。郑天翔等[38]用不同温度的水处理黄芪种子可以提高种子的发芽率和发芽势但效果不明显。这与本试验结果一致，在热水(90℃)是发芽率最高，仅为38.00%，可能的原因与高温干燥处理相同，这也说明这两种方法不宜作为牛枝子种子破除硬实的首选。

液氮处理亦可破除种子休眠。本研究表明，液氮处理虽可以降低硬实率，但发芽率仅为15%左右，效果不佳。与前人在达乌里胡枝子、多花木蓝和二色胡枝子[28-29]结果一致。也有研究表明，用液氮处理苜蓿20 min后，硬实几乎全部破除[39]，说明液氮处理对于不同物种效果存在差异。

4 结论

本试验研究发现，种子破皮机在处理4遍时，牛枝子宿存萼片完全除去，将种子处理9遍时，在破碎率较低的情况下，显著降低了种子硬实率，提高了发芽势和发芽率等，发芽率达66.33%，且操作简单和安全，可作为大规模生产条件下的‘腾格里’牛枝子去除宿存萼片和硬实破除适宜技术进行推广。