汞胁迫对4个草坪草、牧草品种幼苗生长和生理的影响

杜建雄, 任尉香, 袁涓文, 黄慧琼, 刘 杰, 肖 玉

(1.贵州财经大学公共管理学院, 贵州 贵阳 550025； 2.贵州师范大学外国语学院, 贵州 贵阳 550025；3.贵州师范学院生物科学学院, 贵州 贵阳 550018)

现代工业对汞的需求量逐年增加，但离子态汞的毒性较强，容易污染周边生态环境，还能通过食物链富集作用危害人体健康[1]。尤其是近现代汞矿的长期大规模开发利用，使汞化合物已成为矿区周边生态环境及农产品的主要污染源[2]。汞污染地区多以小面积更换表土、增施有机质或大量淋洗的方式来降低土壤汞浓度，这些措施取得了一定的治理效果，但仍存在成本高、费时低效或造成污染扩散的缺陷[3-4]。近年来，采用汞富集能力及耐汞胁迫能力强的植物修复汞污染土壤已成为一种新的发展方向[5]。禾本科及豆科草种发达的地下根系能有效固持土壤，在地表能形成紧密的植被覆盖，是一类理想的水土保持植物[6]。朱剑飞等发现苜蓿(MedicagosativaL.)、黑麦草(LoliumperenneL.)等能在Cu，Pb等重金属污染的土壤中正常生长[7]，且能将土壤中的重金属离子富集到体内，最终可通过反复刈割，移除修剪物来减少土壤的中的重金属含量[8]。但高浓度的汞胁迫同样会抑制植物种子的萌发和生长，植株体内的汞积累会诱导活性氧的积累，造成组织细胞的氧化胁迫伤害[9]。如40 mg·L-1的汞胁迫显著降低桔梗种子的发芽势和发芽率[10]；50 μmol·L-1的汞离子严重抑制小麦幼苗生长，叶片叶绿素含量及根系活力显著下降，丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和游离脯氨酸含量显著升高[11]。因此，选择良好汞耐受及汞富集能力的草种成为汞矿区生态修复所面临的首要问题。杜俊楠发现紫花苜蓿、高羊茅等4种地被植物对汞污染土壤的适应能力存在较大差异，并指出4种牧草在低浓度汞胁迫下对土壤汞有良好的富集能力，但在高浓度汞胁迫下，植株脯氨酸含量和MDA含量增高，抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量下降，4种牧草对汞的富集能力均随之减弱[12]。本研究以沙培盆栽试验结合含汞营养液模拟不同浓度汞胁迫处理，深入探讨前期汞胁迫发芽试验筛选出的4个草坪草、牧草品种在汞胁迫下的生长和生理特性，通过模糊隶属函数综合评价法对4个草种耐汞性进行排序，以期为汞污染土壤植物修复和草种选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试草种‘金皇后’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Golden empress’)，多花黑麦草‘盛宴’(Loliummultiflorum‘Feast’)，紫羊茅‘传奇’(Festucarubra‘Legend’)和‘派尼’(Festucarubra‘Pernille’)的种子于2016年8月购自百绿集团，种子净度均>98%。

1.2 沙培盆栽试验设计

沙培盆栽试验参照李剑峰等的方法[13]，选用过1 mm筛的清洁不含汞河沙，经HCl浸泡4 h并以去离子水浸洗3遍，121℃湿热灭菌2 h后烘干。将参试种子在26.2 cm×18.1 cm，高7.8 cm，盛有河沙(沙面高7 cm)的网底塑料育苗盆中，每盆在沙表均匀放置100粒草种。播种并覆沙0.5 cm后，参照廖翌扬等的方法以含HgCl2营养液对4个草种的种子及幼苗进行胁迫处理[14]。分别将网底育苗盆置于盛有0，30，60，90，120 mg·L-1HgCl2的Hoagland营养液水槽中，营养液自盆底向上缓慢渗透至沙土表面，每个处理5个重复。每5 d分别以5个含不同浓度HgCl2的Hoagland营养液浇灌各处理1次，保证各处理汞胁迫浓度，处理30 d后测定幼苗相关指标。

住院医师规范化培训的培训医师的课堂授课时间紧张，由于临床医师的工作繁忙，对培训医师的理论授课时间一般是小时段集中教学，不会像在校学习的专职教师那样大学时授课教学，所以授课时间有限，而所需要教授的内容却非常多，很多培训医师想要学习和解决的问题没有充足的时间完成。

受益于电商的不只周兴祥，还有枞阳县的几百户贫困户。今年，枞阳县动员每个帮扶责任人帮助每户贫困户家庭销售农产品1000元，预计到12月底，全年可实现建档立卡贫困户网络销售农产品1000万元。

1.3 测定指标和方法

2.1.1出苗率 出苗率能反映种子对逆境的耐受能力[23]。15 d内4个草种的出苗率随汞胁迫浓度升高呈下降趋势(图1)。汞胁迫浓度为30 mg·L-1时，4个草种的出苗率降低1.3%～1.6%，但与对照(0 mg·L-1)差异不显著；汞浓度> 60 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘传奇’、‘派尼’的出苗率显著低于对照(P<0.05)，表明此时汞胁迫对各草种出苗的抑制作用明显；当汞浓度达120 mg·L-1时，‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’和‘盛宴’的出苗率较各自对照分别下降58.7%，58.2%，57.8%和54.7%，说明高浓度汞胁迫对4个草种出苗抑制程度更高。

1.4 数据处理

2.2.2叶片PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm) PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm) 常用于度量植物叶片的光合能力，是表明光化学反应状况的重要参数[28]。由图2可见，随着汞胁迫浓度的升高，‘盛宴’、‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’的Fv/Fm先缓慢降低再急剧下降；30 mg·L-1的汞胁迫浓度下，各草种幼苗的叶片的Fv/Fm较对照并无显著差异，表明此时叶片的光合能力尚未发生明显损伤；当汞胁迫浓度为60 mg·L-1时，‘盛宴’、‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’的Fv/Fm较对照显著下降(P<0.05)，说明幼苗的光合能力已产生实质性损伤；当汞胁迫浓度为到120 mg·L-1时，4个草种的Fv/Fm较对照和30 mg·L-1的处理均有显著下降(P<0.05)，表明高浓度汞胁迫严重影响了4个草种光合作用的正常进行。

式(1)：μxj=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，．．．，n

小麦抽穗后水分需求非常大，要做到“地皮见湿不见干”，但是浇水时要根据墒情和气象预报情况再酌情考虑[5]。

受王水照会长的委托，由我来做会议总结。刚才听了四位小组代表的汇报以后，我觉得我原来准备要讲的许多内容都显得多余了。我非常感谢刚才李朝军(贵州师范大学)、巩本栋(南京大学)、范松义(重庆师范大学)、程杰(南京师范大学)四位先生代表他们小组所作的汇报，他们四个人的发言风格不一样，但是春兰秋菊各有所长，汇报得都很精彩。当然也有一点点的遗憾，因为四个小组发言的都是男性学者，而我们这次会议代表中间，女性学者在数量方面三分天下占其一，所以我们希望下一次年会的小组汇报至少能推荐一至两位女性学者上来报告，女性学者有她们天生的优势，她们比较细致，比较缜密，报告起来会有另外一种风味。

2.1.2株高 株高能直观反映植物的受胁迫程度[24]，随着汞胁迫浓度的升高，各草种30 d幼苗的株高均呈下降趋势(图1)。30 mg·L-1汞胁迫下，‘盛宴’的株高较对照显著降低27.4%(P<0.05)；当汞浓度达60 mg·L-1时，‘盛宴’和‘传奇’的幼苗株高显著下降(P<0.05)；汞胁迫浓度为90～120 mg·L-1时，各草种的幼苗株高均显著低于对照(P<0.05)；汞浓度达120 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘传奇’和‘派尼’的株高分别较对照下降44.7%，52.3%，53.3%和57.5%，表明4个草种幼苗的生长均受到严重抑制。

苏轼于1036—1101年间在世，庆历二年时苏轼不到10岁，且跋中言“桑榆之末景，忧患之余生”，其作时绝非青年时期，因而他所见者绝不可能是唐十五卷本，而只能是宋十卷本。而且苏轼是宋代的大学士，能大量阅读政府公藏书籍，他所见者，应当就是公藏的十卷本，也即《崇文总目》所载者。这也证明了在宋十卷本《嵇康集》中，肯定有《养生论》一篇。

2 结果与分析

2.1 不同浓度汞胁迫对4个草种幼苗出苗率、株高、干重、叶面积的影响

由图1可知，不同浓度汞胁迫对4个草种的出苗率、株高、干重、叶面积具有不同程度的影响。

出苗率从播种之日起每日观察出苗植株并计数，以不再有新苗破土为计数终点，各处理取5个盆栽重复的平均值；沙培试验30 d后将盆栽浸入盛水水槽，待沙基质松散后，无损取出植株，以蒸馏水冲洗3～5遍后以吸水纸吸干表面明水后，每重复盆栽各随机取植株1株用于测定叶面积和株高，之后于烘箱110℃杀青30 min，80℃烘至恒重后测定生物量干重。株高及生物量及参照柯玉琴的方法测定[15]；叶面积参考于龙凤等的方法测定[16]；叶片叶绿素含量参照王学奎等的方法测定[17]；叶片MDA含量以硫代巴比妥酸比色法测定[18]；另于各处理盆栽洗出的无损新鲜植株中各取整株5株，分离下叶片及根系并称重，分别以蒽酮法及TTC法测定[19]叶片可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量及根系活力；参照王佩舒等的方法[20]，用超便携式调制荧光分析仪(MINI-PAM-II德国WALZ)叶绿素荧光特性，叶片预先暗适应30 min后测定Fv (可变荧光)，Fm (最大荧光)，并计算Fv/Fm (叶片PS Ⅱ原初光能转化效率)各处理盆栽以(MINI-PAM-II,德国WALZ)超便携式调制荧光分析仪进行植株叶绿素荧光指标的测定，每处理5盆，每盆随机测定一株作为重复(n=5，下同)。

2.1.3干重 植株生物量直观体现植物在重金属离子胁迫下的生长态势[25]。由图1可知，4个草种幼苗在30 mg·L-1，60 mg·L-1，90 mg·L-1，120 mg·L-1汞胁迫浓度下的干重均显著低于对照(P<0.05)，且幼苗干重的降幅均随着汞胁迫浓度的升高而增大。当汞胁迫浓度为60 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘传奇’和‘派尼’的干重较对照分别降低73.6%，47.0%，57.0%和32.8%。表明在低浓度汞胁迫下，植物生长也明显受抑制，干物质积累量减少；当汞胁迫浓度增大到120 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘传奇’、‘派尼’的幼苗干重分别较对照降低80.7%，74.7%，79.5%和56.8%，表明高浓度汞胁迫严重抑制各草种正常生长。

我的爸爸还是一个幽默搞笑的人。有一次，他无意间捞到了一只青蛙，“看！这只青……”他刚说到这里，那只青蛙就回头看了看他，“扑通”一声跳进了水里，弄得他满脸都是泥水，就像是一只“大青蛙”。我看了一眼被泥水溅成“大花脸”的爸爸，“扑哧”一声笑了出来。

2.2 不同浓度汞胁迫对4个草种幼苗叶绿素含量、PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)的影响

由图2可知，不同浓度汞胁迫对4个草种的叶绿素含量、PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm) 具有不同程度的影响。

2.2.1叶绿素含量 叶绿素是植株进行光合作用的基础[27]。由图2可知，随着汞胁迫浓度的升高，‘盛宴’、‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’幼苗的叶片叶绿素含量随之下降，且各草种幼苗的叶绿素含量在不同汞浓度胁迫下均存在显著差异(P<0.05)。30～60 mg·L-1汞胁迫下，各草种叶片的叶绿素含量均显著低于对照(P<0.05)，表明中低浓度的汞胁迫已足以影响到4个草种幼苗叶片的叶绿素合成与积累；当汞胁迫浓度为90 mg·L-1时，4个草种幼苗的叶片叶绿素含量持续显著下降；当汞胁迫浓度达到120 mg·L-1时，‘盛宴’、‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’的叶片叶绿素含量分别较对照显著降低87.2%，77.1%，75.4%，74.4%(P<0.05)。4个草种中‘盛宴’的叶绿素含量降幅最高，表明高浓度汞胁迫严重抑制幼苗叶片叶绿素的合成。

采用Microsoft Excel 2016进行数据分析处理及图表绘制，参照Li等的方法用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析(Ducan)[21](P<0.05)。参照马婷燕等[22]的方法，运用隶属函数法将各项指标测定值进行标准化处理，按照公式(1) (2)分别计算出出苗率、株高、干重、叶面积、叶绿素含量、PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm)、根系活力、SS含量、和MDA含量9个耐汞指标的隶属函数值。

图2 不同浓度汞胁迫对4个草种幼苗的叶绿素含量、PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm)的影响Fig.2 Effects of different concentration mercury stress on chlorophyll content,PS II original light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of four varieties seedlings

2.3 不同浓度汞胁迫对4个草种幼苗根系活力、SS含量、MDA含量的影响

如图3所示，不同浓度汞胁迫对4个草种的根系活力、SS含量、MDA含量具有不同程度的影响。

2.3.1根系活力 根系活力反映植物在逆境胁迫下的根系生理状况[29]。随着汞胁迫浓度的升高，4个草种的根系活力均随之降低。在低浓度(30 mg·L-1)汞胁迫下，仅‘传奇’和‘金皇后’幼苗的根系活力显著下降，降幅分别为23.3%和43.7%(P<0.05)；当汞胁迫浓度为60 mg·L-1时，‘传奇’和‘派尼’的根系活力开始显著下降(P<0.05)，而‘盛宴’的根系活力直到汞胁迫浓度大于90 mg·L-1时才显著低于对照(P<0.05)。当汞胁迫浓度为120 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘传奇’、‘派尼’的根系活力较各自对照下降了63.9%，76.0%，76.7%，95.8%，表明该浓度汞胁迫均严重抑制各草种幼苗根系的正常代谢活动。

2.1.4叶面积 重金属胁迫会直接影响叶片面积，进而降低植株的光合能力[26]。由图1可知，各草种叶面积随汞胁迫浓度的升高而持续下降。当汞胁迫浓度为30 mg·L-1时，各草种幼苗的叶面积与对照无显著差异，表明此时幼苗叶片的生长尚属正常；当汞胁迫浓度达到60 mg·L-1时，‘传奇’、‘盛宴’、‘派尼’、‘金皇后’幼苗的叶面积较对照均有显著下降(P<0.05)，表明该浓度汞胁迫已对各草种幼苗的生长产生明显抑制作用；当汞胁迫浓度达120 mg·L-1时，‘传奇’、‘盛宴’、‘派尼’、‘金皇后’的幼苗叶面积较对照分别显著下降47.5%，55.6%，58.4%和59.5%(P<0.05)，表明高强度汞胁迫严重抑制各草种幼苗的正常生长，其中‘金皇后’所受的抑制最为明显。

2.3.2可溶性糖含量 叶片SS含量一定程度上反映植株遭遇胁迫以及通过调整胞内渗透势抵御胁迫的能力[30]。由图3可知，4个草种幼苗叶片的SS含量随着汞胁迫浓度的升高呈下降趋势；30 mg·L-1的低汞胁迫下，除‘派尼’外，各草种幼苗叶片的SS含量已显著低于对照(P<0.05)。60 mg·L-1汞胁迫处理下，各草种叶片的SS含量均持续下降(P<0.05)，表明该浓度汞胁迫下，4个草种幼苗通过调节SS含量实施抵御胁迫的能力已受到抑制；汞胁迫浓度达到120 mg·L-1时，‘盛宴’、‘金皇后’、‘派尼’、‘传奇’的SS含量较对照分别下降了66.7%，64.3%，63.6%，62.5%(P<0.05)，表明在该浓度汞胁迫下，各草种植株均已很难通过提高SS含量抵御汞胁迫。

2.3.3MDA含量 MDA作为叶片细胞膜脂过氧化产物，其含量是评价植株所受胁迫程度的重要生理指标[31]。由图3可知，各草种幼苗的叶片MDA含量随着汞胁迫浓度增高而持续升高。30 mg · L-1汞胁迫处理下，除‘盛宴’以外，‘派尼’、‘传奇’、‘金皇后’幼苗的叶片MDA含量均显著升高，意味着低浓度汞胁迫已经开始造成叶片膜系统的损伤；当汞胁迫浓度由60 mg·L-1升高到90 mg·L-1时，4个草种幼苗的叶片MDA含量持续升高(P<0.05)，但‘盛宴’和‘金皇后’的MDA增幅并不显著，表明这一区间内，这两个草种幼苗仍具备一定的抗性；当汞胁迫浓度升高到120 mg · L-1时，各草种叶片的MDA含量均显著升高(P<0.05)。

图3 不同浓度汞胁迫对4个草种幼苗的根系活力、SS含量、MDA含量的影响Fig.3 Effects of different concentration mercury stress on root activity,soluble sugar content,MDA content of four varieties seedlings

2.4 耐汞性综合评价

通过对4个草种的出苗率、株高、干重、叶面积、叶绿素含量、PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm)、根系活力、SS含量和MDA含量这9项指标的隶属函数值进行比较分析(表1)，得出 4个草种总的耐汞性排序为：‘派尼’>‘金皇后’>‘盛宴’>‘传奇’。

表1 隶属函数值及综合排序Table 1 Value of membership function and comprehensive ranking

3 讨论

逆境胁迫下，种子的出苗率首先受到不同程度的影响。本研究中，低浓度汞胁迫(30 mg·L-1)对4个草种的出苗率影响并不显著，而生长30 d后幼苗的生物量则已反映出植株的受害情况，这与其他亚铁离子[13]在低胁迫浓度下刺激生长有所不同，表明汞胁迫对各草种幼苗的伤害从低汞浓度胁迫下就已显现。当汞胁迫浓度达到60 mg·L-1时，‘传奇’和‘派尼’的出苗已表现出明显的抑制效应，90～120 mg·L-1重度胁迫下，4个草种的幼苗根部均开始坏死，可见该胁迫浓度均已超出4个草种幼苗的耐受极限，根部组织结构受到严重损伤，严重影响幼苗的正常生长，这和高大翔等[11]的研究结果一致，即出苗率与植株所受的胁迫程度高度正相关。

汞是非植物生长的必需元素，当植物遇到汞胁迫时，根系是植物面临汞胁迫最先受到损伤的器官，根系膜系统和结构的破坏不但严重抑制根际养分的输送和碳水化合物的合成，更能导致根组织细胞屏蔽外界重金属离子的能力降低[14]。养分的缺乏进一步导致叶绿素的合成受阻，汞离子随水分运输至地上各个组织器官，造成大量氧自由基在整个植株体内的积累[9]，当超出植株自身的抗氧化酶系统及渗透调节系统的生理修复能力后，最终导致幼苗的生长发育和体内干物质积累停滞甚至死亡[32-34]。本研究中，各草种的叶绿素含量、SS含量、根系活力及Fv/Fm值均随植株生物积累量的迅速下降则印证了这一协同过程。如120 mg·L-1的汞胁迫能使各草种幼苗的根系活力和叶绿素含量分别显著降低63.9%～95.8%和74.4%～87.2%(P<0.05)，株高降幅达到44.6%～57.5% (P<0.05)，植株干重和叶面积降幅也分别达到56.8%～80.7%和47.5%～59.5% (P<0.05)，表明高浓度汞胁迫对各草种幼苗的正常生长、光合作用等都产生严重抑制作用，这与镉胁迫对小麦(TriticumaestivumL.)和断续菊(Sonchusasper)生长影响的研究结果基本一致，即镉浓度升高导致小麦[35]和断续菊[36]植株的生物量及株高下降，汞胁迫导致小麦、桔梗(Platycodongrandiflorus)等植物的光合能力、抗氧化酶系统活性下降及干物质积累受到抑制[11-12]。同时在本研究中，各草种的MDA含量均随汞胁迫浓度的升高而持续升高，各草种的MDA含量升高幅度因草种不同存在明显差异，MDA含量升高越明显表明植物受胁迫的生理伤害越严重，进而影响植物正常生长及生理代谢平衡[37]。

由于所耐受的胁迫因素不同，不同植物的生理、生长指标在重度胁迫下的受害表现基本趋同，而在中、低度胁迫下选择适当的评价指标能够迅速直观的筛选出耐受能力较优的草种。在本研究中，除了用生物量和株高评判植物对重金属胁迫的抗性外[24]，对汞胁迫而言，根系活力、叶片叶绿素及MDA含量是直观反映各草种幼苗汞胁迫耐受能力的敏感指标，区分度好，可作为评价草种早期耐汞能力的重要参考指标。利用隶属函数综合评价4个草种的耐汞性，能在一定程度上反映4个草种的耐汞能力。

③二氧化碳气体通入NaClO溶液中,无论二氧化碳少量还是过量,都发生反应CO2+NaClO+H2O==HClO+NaHCO3,而不会生成碳酸钠,因酸性:H2CO3＞HClO＞HCO-3。

4 结论

在不同浓度汞胁迫过程中，当汞胁迫浓度达90 mg·L-1及以上水平时4个草种幼苗的出苗率、叶面积、株高、干重、叶片叶绿素含量，PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)，根系活力、可溶性糖(SS)含量开始明显下降，而丙二醛(MDA)含量明显开始升高，尤其汞胁迫浓度达120 mg·L-1时4个草种各测定指标的变化幅度最明显，表明高浓度汞胁迫已对4个草种幼苗的生长及生理代谢产生了严重的损伤。4个草种总的耐汞性排序为：‘派尼’>‘金皇后’>‘盛宴’>‘传奇’，可为汞污染地区土壤植物修复提供科学参考。