理气通便合剂调节脑肠肽改善便秘型肠易激综合征大鼠内脏高敏感的实验研究*

施琳琳 陈 芳 吴之茵 詹程胹 刘 敏 陶丽媛 李 蒙

1 浙江省中西医结合医院 浙江 杭州 310003

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

肠易激综合征（IBS）是临床常见的功能性胃肠病之一，根据排便习惯改变可分为便秘型（IBS-C）、腹泻型（IBS-D），或便秘与腹泻交替型（IBS-M），同时伴有腹痛或腹胀的感觉[1]。在全球范围内，IBS 患病率在1.1%～45.0%；而在我国，IBS 总体患病率约为6.5%，其中女性患病率略高于男性[2]。IBS-C的发病机制目前尚不明确，研究发现内脏高敏感、肠道动力异常、肠道感染及免疫紊乱等因素参与其中。近年研究也发现IBS症状与肠道微生态相关。除此之外，IBS 患者可能还存在脑-肠轴的互动异常。理气通便合剂是我院在长期临床治疗IBS-C实践中总结出的有效方剂。为探讨理气通便合剂治疗IBS-C 的可能机制，笔者采用冰水灌胃法建立的IBS-C大鼠模型，观察其对IBS-C模型胆囊收缩素（CCK）、神经肽Y（NPY）、P物质（SP）的影响。

1 材料

1.1 实验动物：SPF 级SD 大鼠24 只，雌雄各半，体质量140±20g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司。动物许可证号：SYXK（浙）2018-0012，饲养于浙江中医药大学动物实验中心，饲养环境控制在室温21℃、湿度70%、噪音＜50dB，每笼4 只，自由饮水、摄食。所有的动物实验均通过浙江中医药大学伦理委员会的审批（批准编号：IACUC-20180326-12）。

1.2 药物与试剂：理气通便合剂由生白术、炒莱菔子各12g，黄芪30g，生首乌6g，炒枳实、槟榔、藿香各10g 组成，由浙江省中西医结合医院中药房提供，经浸泡、2 次煎煮、过滤、浓缩至1g/ml，于4℃冰箱保存，用前加温至37℃。枸橼酸莫沙必利5mg/片，日本制药株式会社生产，碾碎后溶于生理盐水，浓度为0.135%，4℃冰箱保存，用前加温。大鼠CCK、NPY、SP的ELISA检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司，批号分别为HR3354120-1、HR4618510-2、HR4234021-2；大鼠CCK、NPY、SP免疫组化抗体，购自Abcam公司。

1.3 耗材与仪器：酶标分析仪：Rayto RT-6100 测试方法和操作步操作：详见操作说明书。Nikon eclipse 80i显微镜，Nikon 公司；DS-Fi1 500 万像素CCD 摄像头，Nikon 公司；Carl Zeiss Imaging Systems 图像分析软件，Carl Zeiss公司。

2 方法

2.1 分组、造模与给药：24 只SD 大鼠，适应性喂养1 周后，以随机数字表法将其随机分为空白组、IBS-C 模型组（模型组）、理气通便合剂治疗组（中药组），莫沙必利治疗组（西药组），每组6 只。采用冰水灌胃法[3]制备IBS-C 大鼠模型，用0～4℃冰水2ml/只每天灌胃1 次，连续灌胃21天；空白组予等量37℃生理盐水灌胃。通过观察粪便性状、粪便颗粒计数对模型进行评价。根据人与动物间按体表面积折算的等效剂量换算法计算中西药物干预剂量。灌胃第8天起中药组予加用理气通便合剂（18.75g•kg-1•d-1）干预，西药组予莫沙必利水溶液（1.35mg•kg-1•d-1）灌胃，空白组及模型组予等量生理盐水灌胃。

2.2 取材：药物干预治疗14天后，禁食24h，不限水，以10%水合氯醛予腹腔注射麻醉后，开腹，迅速取出各组大鼠距肛门5cm 的结肠2.0cm，用生理盐水冲洗干净后以10%甲醛液固定，以备HE染色、免疫组化检测；另剪取附近长约1cm 肠组织标本，存放于1.5ml 冻存管内，以备酶联免疫检测。同时，快速断头取脑，在冰盘上分离大鼠下丘脑区，以10%甲醛液固定，以备免疫组化检测；另取少量下丘脑组织存放于1.5ml 冻存管内，置于液氮，行酶联免疫检测。

2.3 检测指标与方法：①大鼠一般情况及粪便：包括食欲、精神状态、活动情况、体质量和粪便Bristol 分型等。②直肠扩张试验测量大鼠内脏敏感性，通过观察腹部撤离反射（AWR）评分来评价内脏敏感性。AWR 1 分看作是大鼠的感觉阈值，2分作为痛觉敏感阈值，4分作为痛觉最大耐受容量阈值。③大鼠结肠HE染色情况：将石蜡标本连续切片（厚度约4μm），HE 染色后光学显微镜观察各组大鼠结肠黏膜改变。④大鼠结肠、下丘脑CCK、NPY、SP蛋白ELISA检测：用预冷的PBS缓冲液冲洗组织，将组织剪碎后匀浆，后将匀浆液离心，取上清液行ELISA检测，操作严格按照说明书进行。⑤大鼠结肠、下丘脑CCK、NPY、SP 蛋白免疫组化检测：将结肠组织、下丘脑组织从甲醛液内取出，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，用免疫组化法进行结肠组织、下丘脑组织CCK、NPY、SP 含量的测定，具体按照免疫组化说明书步骤进行。阳性结果为细胞染有棕黄颗粒。应用Carl Zeiss Imaging Systems图像分析软件对染色结果进行半定量分析。

2.4 统计学方法：采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计处理，计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05作为评定差异有显著性的标准。

3 结果

3.1 一般情况：造模期间，无大鼠死亡。模型对照组大鼠精神状态不佳，背毛光泽度差，进食量少，粪质干硬，Bristol 分型呈1～2 型。14 天给药治疗结束后，治疗组大鼠精神状态好，背毛光泽，进食量多，粪便Bristol分型呈3～4型。

3.2 直肠扩张试验：与模型组比较，中药组测得的痛觉敏感阈值和痛觉最大阈值的容量阈值分别为1.07±0.16ml 和2.13±0.21ml，痛觉敏感阈值和痛觉最大阈值的容量阈值均明显上升（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠肠道容量阈值（±s，ml）

表1 大鼠肠道容量阈值（±s，ml）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

n 6 6 6 6分组空白组模型组西药组中药组痛觉敏感阈值0.83±0.17 0.74±0.18*1.12±0.25#1.07±0.16#痛觉最大阈值1.89±0.24 1.48±0.20*2.26±0.38#2.13±0.21#

3.3 大鼠结肠HE 染色情况：HE 染色显示，模型组大鼠结肠黏膜病理显示黏膜腺体排列紊乱，黏膜层可见有中性粒细胞浸润，且肌层有断裂现象，与正常对照的空白组差异较大；而药物干预组则与空白组较为接近。

3.4 大鼠结肠、下丘脑CCK、NPY、SP蛋白ELISA检测：与空白组比较，模型组大鼠结肠及下丘脑CCK、NPY表达水平升高（P＜0.05），药物干预后，中药组及西药组大鼠结肠及下丘脑CCK、NPY 水平较模型组有所下降（P＜0.05）。模型组大鼠结肠及下丘脑SP 水平下降（P＜0.05），药物干预后，中药组及西药组大鼠结肠及下丘脑SP较模型组有所回升（P＜0.05）。见表2、表3。

表2 理气通便合剂对大鼠结肠CCK、NPY、SP的影响（±s）

表2 理气通便合剂对大鼠结肠CCK、NPY、SP的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

SP（ng/g）11.749±1.788 10.584±2.493*11.880±0.763#11.994±1.008#分组空白组模型组西药组中药组n6 6 6 6 CCK（pg/g）756.745±64.962 948.236±73.194*856.452±35.278#851.806±41.610#NPY（ng/g）51.360± 8.063 87.075±10.961*76.969± 5.717#70.255±12.377#

表3 理气通便合剂对大鼠下丘脑CCK、NPY、SP的影响（±s）

表3 理气通便合剂对大鼠下丘脑CCK、NPY、SP的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

分组空白组模型组西药组中药组SP（ng/g）21.108±4.224 19.941±2.861*22.056±2.823#23.188±2.426#n6 6 6 6 CCK（pg/g）443.754±10.554 467.792±22.337*416.822±35.220#438.000±8.535#NPY（ng/g）179.790±11.529 377.558±10.987*165.012±17.394#156.034±19.110#

3.5 大鼠结肠、下丘脑CCK、NPY、SP 蛋白免疫组化检测：空白组CCK、NPY 阳性细胞呈棕黄色，模型组阳性细胞胞浆染色较多较深，主要位于黏膜下层肌间神经丛，中药组及西药组与空白组分布、染色接近。空白组结肠SP 阳性细胞主要集中于肌间神经丛，阳性细胞胞浆染色呈棕黄色，模型组阳性细胞胞浆染色较深，数量较多，而中药组及西药组阳性细胞胞浆多染色较少，与空白组分布、染色接近。

4 讨论

随着罗马IV 对IBS 的重新定义，脑-肠轴互动异常在IBS 发病中的作用日益受到重视。胃肠运动、分泌等功能的调控由肠神经系统（ENS）、自主神经系统（ANS）及中枢神经系统（CNS）共同作用完成。脑肠肽是由胃肠道内分泌细胞分泌的小分子肽类物质，在神经系统及胃肠道均有分布，具有胃肠激素和神经递质的双重功能，可参与调节内脏感觉、胃肠道运动、分泌等过程。主要包括5-羟色胺（5-HT）、P 物质（SP）、神经肽Y（NPY）、胆囊收缩素（CCK）、降钙素基因相关肽（CGRP）等。既往有关大量研究显示[4-5]，脑肠肽表达紊乱在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的发病机制中起到非常重要的作用。

CCK 是从十二指肠发现并提取，它能够使胆囊收缩。CCK 广泛分布于消化系统、外周以及中枢神经系统、外周血液等组织器官中，已被证实具有促进胆囊和胃肠平滑肌收缩、调节胃肠蠕动、抑制胃酸分泌、抑制餐后胃排空、抑制结肠转运的作用。NPY 在CNS、ENS，以及许多器官中均有分布，并且含量丰富。在胃肠道，它能抑制肠液和胰液分泌，抑制胃肠道运动。在中枢，它主要参与包括痛觉在内的多项生理功能的调节。本研究显示，IBS-C大鼠NPY 水平在结肠和下丘脑中明显升高，NPY 阳性细胞密度的增加可能会通过增强回肠制动[6]，增加水的吸收并减少肠液的分泌而减慢肠的运输，从而导致便秘。理气通便合剂可以降低NPY 水平，改善便秘症状。SP 属于速激肽家族，广泛分布于CNS、ENS以及胃肠道的细神经纤维内。同时，SP 也可以通过感觉神经放大内脏痛觉。研究表明[7]，IBS-C 患者回盲部及乙状结肠黏膜SP纤维阳性表达较正常组增多、增粗，IBS-C 模型大鼠肠黏膜组织SP 表达增高。本研究发现模型组SP 在肠道肌层表达增强，但结肠、下丘脑SP 水平下降，类似相左的结果也出现在慢传输型便秘的研究中。

IBS-C 属中医学中“便秘”范畴，其主要病机为大肠传导失司，同时又与肝、脾等多个脏腑功能失调密切相关，尤其与肝的条达疏泄密切相关。因此以“理气疏肝，润肠通便”为治法，我院自行组方研制理气通便合剂。目前该方在临床上对功能性便秘及危重患者腹腔高压等疗效确切[8-9]。同时，前期研究也发现[10]，理气通便合剂可降低TRPV1、PAR-2表达，调节神经肽类和兴奋性氨基酸如P 物质、降钙素基因相关蛋白等的释放，导致内脏敏感性增高和胃肠运动功能紊乱。

综上所述，理气通便合剂能改善IBS-C 模型精神状态、进食量和大鼠便秘的症状；亦可明显改善其病理状态，减少炎症细胞浸润，减轻结肠黏膜的充血、水肿。其机制可能是抑制NPY、CCK 表达，加速胃肠道蠕动、调节胃肠液分泌，从而改善便秘症状。SP及其受体NK1R参与IBS-C内脏疼痛敏感的研究值得进一步研究。