缓冲盐类型和离子对试剂非对离子对强离解酸性化合物离子对反相液相色谱保留行为的影响

刘小兰, 高 薇, 梁 超, 乔俊琴*, 王 康, 练鸿振*

(1. 生命分析化学国家重点实验室, 南京大学化学化工学院, 南京大学现代分析中心, 江苏 南京 210023; 2. 泰州医药高新技术产业园区公共平台服务中心, 江苏 泰州 225300; 3. 济川药业集团有限公司, 江苏 泰兴 225441)

反相液相色谱(RPLC)因具有良好的选择性,已成为当今应用最为广泛的色谱分离模式。然而,在分析一些离解性强的化合物时,单一的RPLC体系并不能得到满意的分离效果[1]。离子对反相液相色谱法(IP-RPLC)通过在流动相中添加离子对试剂,增强带相反电荷溶质的保留从而改善分离,主要用于强离解化合物的分离分析[2-7]。在IP-RPLC的应用研究中,科研工作者对影响化合物保留行为的因素一直颇为关注,开展了较为广泛的研究。Fletouris等[8]采用烷基季铵盐作为离子对试剂,对多种青霉素进行IP-RPLC分析,研究了配对离子链长度、流动相pH和浓度,以及柱温对青霉素保留行为的影响。Lu等[9]利用IP-RPLC梯度洗脱研究了氯雷他定及其8种相关化合物的保留行为与流动相pH以及离子对试剂浓度之间的关系。刘文霞等[1]将十二烷基硫酸钠(SDS)作为流动相添加剂,考察了不同色谱条件对表阿霉素及其6种相关物质保留行为的影响,为表阿霉素及其相关物质的分离测定提供了新思路。Burmaoglu等[5]采用蒸发光散射检测器,分别考察了离子对试剂浓度、有机调节剂类型、流动相pH、色谱柱类型、柱温等对唑来膦酸及其相关杂质保留行为的影响,建立了最佳分离分析策略。很显然,在IP-RPLC的应用研究中,人们主要关注离子对试剂的浓度及对离子(counter ion)类型、缓冲溶液的浓度及pH、柱温等对保留的影响,而离子对试剂中的非对离子(non-counter ion)以及缓冲盐类型对溶质保留行为的影响研究相对较少。

定量结构-保留行为关系(QSRR)模型可以沟通溶质保留与疏水性参数正辛醇-水分配系数(logP)之间的关系,可用于溶质保留行为的预测或者logP的测定[10]。对于离解性化合物,通常用表观正辛醇-水分配系数logD代替logP。研究[11]发现,在RPLC中以100%水相作流动相时的保留因子对数值(logkw)与logP或logD之间具有很好的相关性。Logkw可由线性溶剂强度(linear solvent strength, LSS)模型外推获得[12]:

logk=logkw-Sφ

(1)

k为溶质的保留因子,φ是流动相中有机调节剂的体积分数,S是线性回归得到的常数。

当溶质在流动相和固定相上达到相等分配(k=1, logk=0)时,对应的有机调节剂比例称为色谱疏水指数(chromatographic hydrophobicity index, CHI)。有文献[13,14]指出,在引入溶质氢键描述符的情况下,CHI与logP以及logD之间也存在着较好的线性关系。CHI可通过logkw和S计算[15]:

CHI=logkw/S

(2)

本文以14种磺酸化合物为研究对象,在硅胶基质C18柱上,以甲醇为有机调节剂,采用IP-RPLC进行保留行为研究。首先,固定流动相中离子对试剂为四丁基溴化铵不变,考察缓冲盐类型(磷酸二氢铵、氯化铵和乙酸铵)对磺酸化合物保留行为的影响;然后,固定流动相中缓冲盐为磷酸二氢铵不变,考察四丁基季铵盐离子对试剂(四丁基溴化铵、四丁基磷酸二氢铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基硝酸铵和四丁基乙酸铵)中阴离子对磺酸化合物保留行为的影响,并探索了IP-RPLC的保留机制。最后,对logkw、S、CHI与logD的相关性进行了比较。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

实验所用高效液相色谱仪为Waters Alliance 2695(Waters,美国),仪器配有真空脱气机、数码四元泵和120位自动进样器。数据的采集和处理均在Waters Empower色谱管理系统中进行。用996紫外-可见二极管阵列(PDA)检测器在每个化合物的最佳吸收波长处检测其吸收峰。流动相pH值使用SevenMulti型pH/电导率/离子综合测试仪(Metter-Toledo,瑞士)测量。

实验中所用甲醇(HPLC级)购自美国Honeywell公司,所用水均为饮用纯净水(杭州娃哈哈集团);分析纯磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、乙酸铵、氯化铵、氨水(25%～28%)、磷酸(85%)、冰乙酸(98%)和盐酸(36%～38%)均购自南京化学试剂股份有限公司;四丁基溴化铵(99%)购自百灵威公司(上海),四丁基硫酸铵(99%)购自安耐吉化学(上海),四丁基乙酸铵(98%)和四丁基磷酸氢铵(99%)购自毕得医药科技有限公司(上海),四丁基硝酸铵(99%)购自艾览化工科技有限公司(上海)。

本实验中对14种磺酸类化合物进行研究,具体信息见表1。其中,logD7.0值(pH=7.0条件下的logD值)是由本课题组前期工作中利用IP-RPLC测试得到的实验值[16], pKa值由ACD/Labs软件计算得到,溶质静电荷ne、氢键酸性参数A、氢键碱性参数B、极性表面积PSA由https://ilab.acdlabs.com/iLab2/获取。磺酸化合物分别购自Accu Standard(美国)、TCI(日本)、国药集团化学试剂有限公司(上海)、Acros Organics(美国)、Matrix Scientific(美国)和Sigma-Aldrich(美国)。所有物质的纯度均大于98%,用甲醇配制成储备液(1.0 g/L),置于4 ℃冰箱中备用。

表1 化合物的log D7.0、pKa、ne、A、B和PSA值

1.2 色谱条件

色谱柱:Welch Ultimate®XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量:5 μL。各化合物的进样质量浓度均为50 mg/L,所有样品的保留时间(tR)均为至少3次独立进样的平均值。

流动相①: (甲醇+10 mmol/L四丁基溴化铵)-(20 mmol/L缓冲盐+10 mmol/L四丁基溴化铵,pH 7.0),分别使用磷酸二氢铵、氯化铵和乙酸铵作为缓冲盐。

流动相②: (甲醇+10 mmol/L四丁基季铵盐)-(20 mmol/L磷酸二氢铵+10 mmol/L四丁基季铵盐,pH 7.0),分别使用含不同阴离子的5种四丁基季铵盐(四丁基溴化铵、四丁基磷酸二氢铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基硝酸铵和四丁基乙酸铵)作为离子对试剂。

1.3 实验方法

采用尿嘧啶测定死时间t0,所有化合物均使用等度洗脱,根据化合物疏水性差异,每个化合物至少在4个不同的甲醇体积百分数(70%～10%,间隔5%～10%)下测定tR,使用双点校正法(DP-RTC)校正[17]。根据k=(tR-t0)/tR计算保留因子k,根据方程(1)建立logk-φ方程,求得kw和S值,根据方程(2)计算CHI值。采用Origin 9.4进行相关模型建立及数据分析。

2 结果与讨论

2.1 缓冲盐类型对磺酸化合物保留行为的影响

由于磺酸化合物具有较小的pKa值(见表1),在实验环境下(pH=7.0)带有完全的负电荷,为典型的强离解化合物,并且磺酸化合物具有明显的紫外特征吸收,可用使用最为普遍的二极管阵列检测器进行检测,因此,我们选择磺酸化合物作为模型化合物。在分析强离解酸性化合物时,四丁基季铵盐为最常使用的离子对试剂,在pH=7.0的条件下,四丁基季铵盐带正电荷,与磺酸化合物形成离子对。实验中采用甲醇作为有机调节剂,固定流动相中离子对试剂为四丁基溴化铵不变,分别以磷酸二氢铵、氯化铵和乙酸铵作为缓冲盐(浓度相同,pH相同),考察缓冲盐类型对磺酸化合物保留行为的影响。

在不同的甲醇比例下,分别获取3种缓冲盐条件下磺酸化合物的k值,并建立logk-φ模型(方程(1)),结果发现,模型的线性相关系数R2均大于0.99。由logk-φ模型获取每个化合物在不同流动相下的logkw和S值,并根据方程(2)计算各化合物的CHI值。3种缓冲盐体系下磺酸化合物的logkw、S和CHI值如图1所示。从图1a可以看出,氯化铵体系下溶质的logkw值最大,而大部分溶质在磷酸二氢铵体系下的logkw值最小,表明流动相中氯离子的存在有利于增强磺酸化合物的保留。图1b显示大部分溶质在氯化铵体系下的S值最大,但SA2、SA4、SA5和SA13在乙酸铵体系下的S值明显大于其他两种缓冲盐体系。图1c显示各化合物的色谱疏水指数CHI在乙酸铵体系下最小。尽管在3种缓冲盐体系下的CHI值存在一定差别,但总体上同一化合物在各体系下对应的CHI值近似相等(见图1c)。

图1 不同缓冲盐体系下磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 1 (a) log kw(logarithm of retention factors of soluteswhen 100% aqueous phases were used as the mobile phase), (b) S (intercept of the linear solvent strength model) and (c) CHI (chromatographic hydrophobic index) values for sulfonic acid compounds with different buffer solutions

2.2 离子对试剂非对离子对磺酸化合物保留行为的影响

图2 离子对试剂不同阴离子时磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 2 (a) log kw, (b) S and (c) CHI values forsulfonic acid compounds with different ion-pair reagents Br-, CH3COO-, represent different quaternary ammonium ion-pair reagents (tetrabutylammonium bromide, tetrabutylammonium hydrogen sulfate, tetrabutyl ammonium acetate, tetrabutylammonium hydrogen phosphate and tetrabutylammonium nitrate, respectively).

2.3 IP-RPLC的保留机理

对IP-RPLC的保留机理一直存在着两种不同的观点,一种认为是离子对模式保留机理,离子对试剂与带相反电荷的分析物在流动相中首先形成中性物质,然后中性物质分配到疏水性固定相中[19];另外一种认为是动力学离子交换模式保留机理,离子对试剂首先被吸附到固定相上,在固定相表面产生电荷位点,作为带相反电荷分析物的离子交换位点[20]。

在动态离子交换模式保留机理中,疏水性的四丁基铵盐可以吸附在固定相表面,形成双电层,磺酸化合物通过与阴离子的交换实现保留,保留主要取决于磺酸化合物所带阴离子电荷的数量。然而,我们的实验表明,具有2个净电荷(ne=-2)的化合物SA2、SA6、SA10的保留(logkw)甚至比相同色谱条件下只有1个净电荷(ne=-1)的化合物(SA7、SA12等)的保留弱(见图1a和2a)。相反,保留最强的化合物为SA11,对应净电荷为-1.14,具有最大的logD值(-0.33),即疏水性最强。因此,动态离子交换模式保留机理占主导地位不成立,猜测离子对模式保留机理占主导地位。

2.4 log kw、S、CHI与log D相关性的比较

在IP-RPLC模型下,电荷作用和氢键作用均会影响离解化合物的保留,可以在logD-logkw模型中引入溶质静电荷ne、氢键酸碱性参数A和B,建立QSRR模型[14],用于logD或保留的预测。在磷酸二氢铵、氯化铵和乙酸铵3种缓冲盐体系下,我们分别以14种磺酸化合物的logD7.0、logkw、ne、A和B进行多元线性拟合,建立QSRR模型,结果如表2所示。可以看出,3种流动相条件下的logD7.0和logkw之间均有良好的线性相关性,R2达到0.98。为了进一步改善方程的相关性,我们将溶质的极性表面积PSA引入到上述方程中,发现方程的R2进一步增大,线性得到改善。同样,在引入参数ne、A和B的情况下,以S对logD7.0作线性方程,可以得到良好的线性相关性,当引入PSA后,氯化铵体系下的线性相关性得到明显改善,线性相关系数R2由0.96增大到0.99(见表2)。最后,分别对3种缓冲盐体系下得到的CHI对logD7.0进行线性拟合,结果显示,PSA引入前后logD7.0-CHI模型的线性相关性R2均在0.98以上。表2中的结果表明,溶质的极性表面积PSA会影响溶质的保留,PSA的加入有利于logD7.0-logkw、logD7.0-S和logD7.0-CHI模型的改善。

引入溶质静电荷ne、氢键酸碱性参数A和B、极性表面积PSA,分别用14种磺酸化合物的logD7.0值与在5种不同离子对试剂条件下得到的logkw、S以及CHI值,进行多元线性拟合,得到如表3所示的线性方程。可以看出,logD7.0和logkw、S以及CHI之间均具有良好的线性关系,相关系数R2均在0.98以上。

用IP-RPLC研究logD相关的QSRR模型,通常以logkw作为疏水性指数,建立logD和logkw之间的线性关系。我们的研究发现,logD与S以及CHI之间也具有良好的线性相关性。强离解酸性化合物进行IP-RPLC分析时,当流动相中使用不同的缓冲盐阴离子或者离子对试剂阴离子,即使得到的logkw和S值存在一定差异,但最终获取的色谱疏水指数CHI几乎相等。因此,相比logkw和S而言,CHI更适用于QSRR模型的建立。

3 结论

本研究发现IP-RPLC中缓冲盐阴离子以及离子对试剂阴离子均会影响磺酸化合物的保留行为。相同离子对试剂情况下,氯化铵体系下的logkw最大;相同缓冲盐的情况下,离子对试剂中弱离解性阴离子(乙酸根)的存在有利于增加磺酸化合物的S值。我们推测磺酸化合物的IP-RPLC保留机理同时存在着离子对模式和动态离子交换模式,并以离子对模式为主。对于强离解酸性化合物,由于在IP-RPLC不同缓冲盐和不同非对离子条件下获得的logkw和S值存在着一定的差异,而CHI值相对稳定,因此CHI更适用于QSRR模型的建立。