手机成像在生物活性物质实验教学中的应用

谢旭婷，Cheong Kit-Leong

（汕头大学理学院生物系，广东 汕头515063）

目前实验教学依然在高校所开设课程中占极大比重，其对提高学生的动手实操能力以及实践创新能力都有着举足轻重的作用。在传统的生物活性物质实践课教学过程中，受器材、专业实验员数量、学生人数等因素限制，往往多为验证性实验或模拟实操，不能保证每位学生的参与。为了培养学生的实践能力与创新能力，提高实验教学效果，在保留原有的生物活性物质实验课程的基础上，对实际操作进行了一定创新，以求在达到教学目的的同时激发学生的创造性，提高其学习热情。

近年来随着对生物活性物质的研究与开发利用的深入，对天然来源的低聚糖的研究也越来越受到关注。低聚糖是一种低分子量、低聚合度的糖类化合物，由2～20个单糖通过糖苷键连接而形成直链或支链，因其多样的生物活性如抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤和免疫调节等受到业界广泛关注。而由于结构与功能之间存在的紧密联系，对低聚糖的结构分析也成为当前研究热点。但目前对低聚糖混合物的分离和性质研究仍是糖类研究中的难点之一，其主要原因是糖分子因缺乏生色基团或荧光基团，使其直接检测困难，并且由于低聚糖的化学组成类似，存在多种异构体，且具有不同的连接方式和分支形式，其结构异常复杂多样，因此分离难度很大。常用的低聚糖结构分析方法包括高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱（MS）、核磁（NMR）以及薄层色谱（TLC）和荧光辅助糖电泳（FACF）等。其中HPLC具有重现性好、分辨率高等优点，常用于糖类的定量分析，但其样品前处理过程比较繁琐；GC一般要求样品具备一定的挥发性和热稳定性；NMR在确定低聚糖化学结构上具有高特异性、高灵敏度、结果信息丰富等优点。但这些方法需要昂贵的仪器和专业技术人员，并且它们在应用上具有一定的局限性；而采用TLC法虽然操作简单，但分辨率低且不能将结构相似的糖组分分开；相比而言，FACE则是一种简单、快速、灵敏的糖类分析方法，其可同时对多个中性和酸性低聚糖样品进行分析，因此较适用于低聚糖的分离。

FACE操作简单且不需要昂贵仪器以及专业技术人员，学生均可参与实验，是一种比较适用于本科教学实验的方法。传统FACE实验中使用凝胶成像分析系统对低聚糖电泳条带进行拍照，而因各实验室凝胶成像分析仪数量有限，学生往往需排队轮流使用或分小组派代表进行操作。为了达到使每位学生在既定课堂时间内均参与实验的目的，我们在传统的FACE实验基础上，利用智能手机空间成像系统在紫外暗箱中对电泳所成低聚糖分离条带进行拍照，并与传统实验中使用凝胶成像分析系统所获取的图片进行分析对比，以期在提高教学质量的同时获得更快速简便的低聚糖糖谱分析技术。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

昆布二糖、三糖、四糖、五糖标准品，Solarbio公司；琼胶二、四、六、八、十、十二糖标准品，Solarbio公司。

氨基-1，3，6-萘三磺酸二钠盐（ANTS）；氰基硼氢化钠（NaBHCN）；二甲亚砜（DMSO）；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；过硫酸铵（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl）；乙酸；尿素；甘氨酸；氢氧化钠，以上试剂均为分析纯，用水为蒸馏水。

1.2 主要仪器

电泳仪；华为智能手机；苹果智能手机；凝胶成像分析系统；天平；氮吹仪；冰箱。

1.3 实验方法

（1）溶液配制

配制0.1 mol/L ANTS溶液，1 mol/L NaBHCN溶液，6 mol/L尿素，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，10%AP，pH 8.8 Gly-Tris电泳缓冲液，含37%丙烯酰胺与3%双丙烯酰胺的分离胶与浓缩胶母液，棕色瓶4℃保存。

（2）ANTS衍生化

取聚合度分别为2、3、4、5的昆布寡糖标准品各5 mg分别溶解于1 mL 50%的乙醇水溶液中，配制昆布寡糖原始样液，从各样液中各取60μL混合得昆布寡糖标准品母液。将母液氮气吹干或冻干，加入20μL 00.1 mol/L ANTS溶液和20 L 1mol/L NaCNBH溶液，混匀后置37℃水浴衍生化16 h。然后于35℃将糖样品吹干，加300μL 6 mol/L尿素重悬得昆布寡糖样品溶液，-20℃冰箱保存备用。

同上，取聚合度分别为2、4、6、8、10、12的琼胶寡糖标准品各5 mg溶解衍生得琼胶寡糖样品溶液，-20℃冰箱保存备用。

（3）制胶

将玻璃板清洗干净，待用。根据ZHANG等电泳方法稍作修改，按表1分别配制分离胶和浓缩胶，先配制好分离胶后立即缓缓注入制胶槽，缓慢加入1 mL水压实，待分离胶完全凝固后把水吸出，注入浓缩胶，并在上方放置合适梳子以形成加样孔。浓缩胶凝固后轻轻拔出梳子，将凝胶连同胶槽板一起放入装有适量缓冲液的电泳槽内待用。

表1 分离胶和浓缩胶的配制Tab.1 Preparation of separation glue and concentrated glue

（4）加样

使用移液器分别吸取10μL稀释64、32、24、16、8、4、2倍的昆布寡糖样品溶液，缓慢加至浸没电泳缓冲液的加样孔内。

使用移液器分别吸取10μL稀释64、32、24、16、8、4、2倍的琼胶寡糖样品溶液，缓慢加至浸没电泳缓冲液的加样孔内。

（5）电泳

将电泳槽放在冰水浴中，连接正负极，启动电源，设置电压、电流、功率、时间分别为350 V、150 mA、30 W、2 h；电泳结束后在365 nm紫外灯下观察。用凝胶成像仪、苹果手机和华为手机分别拍照、保存、分析。流程如图1所示。

图1 实验流程Fig.1 Experimentalprocess

2 结果与分析

2.1 ANTS与糖衍生化机理

ANTS衍生反应过程同其他胺化还原反应相同，首先还原糖分子在溶液中存在着半缩醛和醛之间的动态平衡。然后标记物ANTS的氨基与糖的还原端（醛基）发生亲核反应，消除一分子水，产生席夫碱（Schiff′s base），形成醛与席夫碱之间的动态平衡，最后氰基硼氢化钠将生成的席夫碱迅速专一地还原成稳定的二级胺。见图2。

图2 ANTS与糖衍生化反应机理示意图Fig.2 Schematic diagram of derivative reaction mechanism between ANTS and sugar

2.2 寡糖电泳结果

通过衍生化反应，寡糖分子的还原末端结合荧光集团，经聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳进行分离，最终得到的结果经过紫外灯照射后，可以根据电泳条带的数量及荧光强度判断出寡糖的成分及其含量，根据电泳结果得到不同数量条带，代表不同聚合度的寡糖。寡糖与ANTS进行衍生反应，在紫外透射光条件下显示荧光条带，每个条带代表一种寡糖。图3、图4为不同成像设备拍照所得的昆布寡糖和琼胶寡糖凝胶分离谱图及利用Quantity one与Origin软件转换的对应峰图。

图3 昆布寡糖标准品电泳条带与对应峰图Fig.3 The electrophoretic bands and corresponding peaks of laminaria oligosaccharide standards

图4 琼胶寡糖标准品电泳条带与对应峰图Fig.4 The electrophoretic bands and corresponding peaks of agar oligosaccharide standards

由图3可知，不同聚合度的昆布寡糖的分离效果明显。这是由于聚合度小的糖比聚合度大的糖迁移得快导致的结果。由电泳条带可以看出，有4种组分得到了有效的分离，根据条带位置可判断由上至下分别代表聚合度为5、4、3、2的昆布寡糖。通过对比三种成像方式得出的照片可明显得出，利用智能手机成像系统拍照得出的电泳条带图分辨率更高，凝胶成像仪显现5条泳道的条带图，而智能手机可显现6条泳道的条带图。与之对应的峰图也进一步证实此结果，且由峰图可知，智能手机成像系统所得照片各条带的丰度明显高于凝胶成像仪所成照片中各条带丰度。

由图4可知，不同聚合度的琼胶寡糖分离效果明显。由电泳条带可以看出，有6种组分得到了有效的分离，根据条带位置可判断由上至下分别代表聚合度为12、10、8、6、4、2的琼胶寡糖。同上，对比三种成像方式得出的照片可明显得出，利用智能手机成像系统拍照得出的电泳条带图分辨率更高，凝胶成像仪清晰显现5条泳道的条带图，而智能手机可清晰显现7条泳道的条带图。与之对应的峰图也进一步证实此结果，并且由峰图可知，智能手机成像系统所得照片各条带的丰度明显高于凝胶成像仪所成照片中各条带丰度。

3 结论

本实验中，在寡糖分子中引入荧光基团ANTS后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地分离鉴定不同聚合度的寡糖混合物。根据不同聚合度的寡糖分子在电场中的迁移速度不同可迅速分离不同聚合度的寡糖，并由条带位置判断各聚合度寡糖。结合电泳条带与其对应的峰图可得出，使用智能手机成像系统拍摄的照片比凝胶成像仪所成的照片具有更高的分辨率，且各条带对应峰的丰度明显高于凝胶成像系统拍摄的照片。再者，使用智能手机成像系统拍摄电泳结果图的方法，操作简单，设备充裕，不需要特别昂贵的仪器和操作熟练的技术人员，在一般实验室中就可以完成这项工作，因此可作为一种新型实验方式应用于教学实验中。

本实验在传统基于凝胶成像系统拍摄电泳条带照片的内容下，采取了一种新型的实验方式，利用智能手机成像系统对电泳结果进行拍照，使用Quantity One与Origin软件进行峰图转换，得出利用智能手机成像系统可完成电泳结果的拍摄要求，且明显优于凝胶成像系统所得照片。这一方法可应用于高校生物活性物质实验课程中的电泳实验课程，尤其是对糖类物质的分离鉴定，加之目前学生基本人手一部智能手机，因此实验取材方便，且相较于凝胶成像仪，智能手机更经济适用且不需专人指导，弥补了高校生物活性物质实验课程中因实验设备凝胶成像仪数量不足造成的学生无法全部实操的缺憾。

实验中采用的新型实验方式开发了学生的创造性，提高了学生参与课程的积极性，增强了学生对生物活性物质实验课的兴趣。实验中每位学生都参与并对自己所拍摄的照片进行峰图转换与分析，不仅提升了必要的实验技能，也掌握了结果处理与分析的能力，培养了学生独立分析和解决问题的能力。同时该方法还能更好地活跃课堂氛围，有助于学生对知识的记忆，并且对教师提高课堂效果，完成教学目标具有一定助益。