Box-Behnken设计优选加味结石汤的提取工艺△

胡静，汪毓文，徐林忠，夏志持

麻城市人民医院 药剂科，湖北 麻城 438300

加味结石汤是麻城市人民医院传统协定处方，由金钱草、连钱草、山楂、鸡内金、车前子、滑石等12 味中药组成，具有清热利湿、通淋消石的功效，临床用于湿热引起的肝胆结石、黄疸、尿路结石、石淋、热淋、小便涩痛等[1-3]。鉴于传统汤剂临床服用携带不便、质量不可控等缺点，为了保证临床效果，故拟将该方开发研制成加味结石颗粒剂。本实验以总黄酮提取率和干浸膏得率为评价指标[6]，采用Box-Behnken响应面法对该颗粒剂的提取工艺进行优选，以期为临床院内制剂的应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

53-WB 型紫外-可见分光光度计（上海光学仪器厂）；WGL-230B 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；QUINTIX125D-1CN 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HH-6型恒温水浴锅（江苏中大仪器科技有限公司）。

1.2 试药

金钱草（批号：191001-X）、连钱草（批号：190501-X）、山楂（批号：20190801）、鸡内金（批号：20191001）、车前子（批号：20191001）等购于亳州市善安堂中药饮片有限公司，经麻城市人民医院药剂科主任中药师徐林忠鉴定为正品；对照品芦丁（纯度：98%，批号：190705，北京普天同创生物科技有限公司）；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取芦丁对照品12.61 mg，置25 mL量瓶中，加70%乙醇约20 mL，密塞，超声使其溶解，放冷，定容，即得（0.5045mg·mL-1）。

2.1.2 样品溶液的制备 取0.2 倍量处方中药，加入适宜体积的水，浸泡30 min，提取相应次数，滤过，滤液合并，浓缩至适量，放冷至室温，加水定容至50 mL量瓶中，备用。精密吸取提取液5 mL，置50 mL量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，超声20 min，滤过，精密吸取续滤液2 mL置5 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

2.1.3 最大吸收波长的确定 分别吸取对照品和样品溶液各1 mL，使用硝酸铝显色法，于200～800 nm波长处扫描，发现两者均在510 nm 的波长处有最大吸收（图1），故选用510 nm 作为检测波长。

图1 加味结石汤供试品溶液和芦丁对照品溶液紫外扫描图

2.1.4 线性关系考察 精密吸取2.1.1 项下对照品溶 液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，分别加5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，最后加4%氢氧化钠溶液4 mL，70%乙醇定容至10 mL，混匀，静置15 min[4]。以相应试剂为空白对照，在510 nm 处测吸光度，以吸光度值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得回归方程：Y=0.011 5X-0.001 1（r=0.999 8），在12.36～74.16μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取质量浓度为0.037 08 mg·mL-1的对照品溶液，按2.1.4 项下方法，连续测定6 次，RSD为0.13%，表明仪器精密性良好。

2.1.6 稳定性试验 精密移取同一份样品溶液1.0 mL，按2.1.4 项下方法，于5、10、15、20、25、30 min测定，RSD 为0.55%，表明供试品溶液在30 min 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取0.2 倍量处方药材，按照样品制备方法（液料比为12∶1，煎煮时间为1.5 h，煎煮次数为2 次）平行煎煮6 份样品，按2.1.4 项下方法测定吸光度值并计算总黄酮含量，RSD 为1.72%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称定0.1 倍量处方药材，共6份，精密加入芦丁对照品溶液适量（与0.1倍处方药材所含黄酮量相当），按照样品制备方法（液料比为12∶1，煎煮时间为1.5 h，煎煮次数为2次）煎煮样品，按2.1.4项下方法测定吸光度，测得平均回收率为97.78%，RSD 为2.91%，加样回收率符合要求。

2.2 干膏得率的测定

精密吸取样品提取液20 mL，放置于蒸发皿（经干燥至质量恒定），在水浴中蒸干，保持105 ℃温度条件，5 h 后于干燥器冷却1 h。快速称取质量，根据公式（1）计算出膏率[5]。

式中，W为出膏质量，M为药材质量，V为样品溶液的体积。

2.3 单因素试验

以总黄酮含量和干膏得率为指标，采用加权综合评分法，两者的权重分别为50、50，按公式（2）计算综合评分[6]。

对液料比（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）、煎煮时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、煎煮次数（1、2、3 次，考虑到成本和实际生产，煎煮次数试验只选1、2、3 次）这些因素进行考察，结果显示，加水量为12 倍时综合评分最高，煎煮时间为1.5 h时综合评分最高，综合评分随着煎煮次数的增加而增加，煎煮次数为2 次时，综合评分急剧增加，当煎煮次数达到3 次时，综合评分曲线增加变缓，说明继续增加煎煮次数已无实质性意义。

2.4 Box-Behnken法优化加味结石汤提取工艺

2.4.1 响应面法优化试验设计及结果 据单因素试验结果，选择液料比（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）3 个因素作为考察对象，每个因素三水平（表1），根据Box-Behnken 响应面试验设计方案，总共设计17组，见表2，采用Design-Expert 8.0.6软件对综合评分数据进行回归，结果见表3。

表1 加味结石汤提取工艺响应面试验因素与水平

表2 加味结石汤提取工艺响应面试验设计与结果

表3 回归模型方差分析

使用统计软件Design Expert 8.0.6 对表2 中各指标性成分的综合权重数据进行多元回归拟合，得回归方程：Y=97.20-0.33A-2.38B+4.53C+0.95AB-3.57AC-1.97 BC-5.22A2-11.24B2-8.16C2，3个因素中对加味结石汤提取工艺影响结果依次为C＞B＞A。回归模型P＜0.000 1，说明此模型具有显著性，且r=0.988 6，表明模型拟合度良好，失拟项P＞0.05，表明模型失拟不显著，试验误差小，说明可以很好地对加味结石汤的提取工艺进行预测和分析。

2.4.2 响应面分析 根据响应方程绘制响应面曲面图，见图2，从图2可以看出，两两因素交互作用对响应值的影响，随着各因素的水平值增加，综合评分值会出现一个峰值，当各水平持续升高时，综合评分值又下降或坡度相对平缓，如随着煎煮时间的增加，综合评分先升高后下降，煎煮次数由1 次升高为2 次时，提取效率显著升高，当煎煮次数增加为3 次时，曲面相对平缓。使用Design-Expert 8.0.6软件分析优化过后的最佳提取工艺条件为液料比11.37∶1，煎煮时间1.46 h，煎煮次数2.31 次，在此条件下，综合评分最大值为97.95。考虑到实际操作过程中的局限性，将各参数调整为液料比12∶1，煎煮时间1.5 h，煎煮次数2次。

图2 加味结石汤各因素交互作用的响应面图

2.5 验证实验的结果分析

进一步对提取工艺进行验证，考察所得优化后的提取工艺的稳定性，按照处方比例称取药材3 份，加12 倍量水，煎煮2 次，每次1.5 h，测得总黄酮平均提取率为2.29%，干膏得率为22.20%，都接近响应面法最优数据的理论值，表明该方法准确可靠。

3 讨论

本实验选择了干膏得率和总黄酮含量作为双指标，其原因为浓膏的出膏率对制剂后续的醇沉、制粒等工艺操作影响较大[7]，另一方面加味结石汤方中重用金钱草、连钱草为君药，两者质量占整个方子总量的40%，金钱草、连钱草主要化学成分均为黄酮类[8-10]。研究报道，金钱草的利尿排石作用机制可能为提取液中黄酮类成分的羰基和酚羟基与草酸根竞争性结合钙离子的结合位点有关，从而达到减少草酸钙的形成[7，11]。

响应面分析法被广泛应用于中药有效成分的提取，该方法试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高且能够研究几种因素间的交互作用[12-13]，与传统方法相比，能更直观、更准确得到最优组合。

肝胆结石和泌尿系统结石是临床的常见病、多发病，发病率呈逐年增高趋势，并严重危害人类的健康和生命[1,14]。加味结石汤是麻城市人民医院传统协定处方，该方以中药传统方《太平惠民和剂局方》记载的八正散（车前子、瞿麦、扁蓄、滑石、栀子、甘草、木通、大黄）加减所得[15]，根据药物特点，可同时兼顾治疗肝胆结石和尿路结石。本实验采用Box-Behnken 响应面法优化其提取工艺，为该方开发成治疗结石的颗粒制剂提供参考。