续断“发汗”条件及川续断皂苷Ⅵ含量与色度的相关性研究△

周太敏，龚安慧，何华，李良远，徐娇，江维克，周涛

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperWall.ex Henry 的干燥根，含有三萜皂苷类、环烯醚萜类、挥发油类、生物碱类等化学成分，具有补肝肾、强筋骨、安胎等功效[1]。“发汗”是一种常见的中药材产地加工技术，《中华人民共和国药典》2020 年版规定，续断等5 种药材需经“发汗”加工。其中，续断的加工程序：用微火烘至半干，堆置“发汗”至内部变绿色时，再烘干；同时，规定川续断皂苷Ⅵ质量分数不低于2.0%。这表明通过“发汗”使“内部变绿”是药材质量合格的表现。传统经验也认为，续断断面墨绿色为佳[2-3]。已有研究表明，续断在“发汗”过程中，川续断皂苷Ⅵ等化学成分含量有明显变化[4-6]，但这种颜色变化和成分含量变化的相关性并不清楚。本研究对续断“发汗”条件及“发汗”前后的续断中川续断皂苷Ⅵ含量与外观颜色进行量化，探讨两者的相关性。

1 材料

1.1 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；AG285型电子天平（瑞士梅特勒公司）；SK1200H 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器公司）；GM-1.33A 型真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；UPT-Ⅱ-20T 型纯水仪（成都超纯科技有限公司）；EOS 60D型照相机（Canon公司）。

1.2 试药

新鲜续断采于贵州省龙里县，经贵州中医药大学江维克教授鉴定为川续断科植物川续断Dipsacus asperWall.ex Henry的根。

对照品川续断皂苷Ⅵ（山东省分析测试中心，批号：111685-201305，纯度：99.29%）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；95%乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 续断中川续断皂苷Ⅵ含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.048 0 mg·mL-1的对照品储备液，并用甲醇稀释至质量浓度为0.209 6 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取药材细粉约1 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定质量，回流提取2 h，放冷，补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液30 mL至50 mL量瓶中，70%乙醇定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 色谱条件 Symmetry-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱（0～30 min，9%～21%A；30～65 min，21%～22%A；65～90 min，22%～60%A；90～100 min，60%～9%A）；流速为0.7 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为212 nm；进样量为10 μL[7]。

2.2 续断“发汗”相对含水量计算方法

通过控制样品质量，间接控制样品相对含水量。相对含水量是指川续断样品的含水量占饱和含水量的百分比；相对含水量的测定：将采收的续断根用清水洗净，滤纸吸干表面水分，称取适量续断3 份，称质量（此时称为饱和鲜质量M1）；105 ℃下烘干至质量恒定，称为干质量M2；M3为对应含水量样品的干质量。按公式（1）计算相对含水量。

相对含水量=(M1-M3)/(M1-M2)×100% （1）

2.3 续断“发汗”工艺正交试验设计

利用L9（34）正交设计，以相对含水量（A）、发汗温度（B）及发汗时间（C）为考察因素，川续断皂苷Ⅵ含量为指标，优选续断的“发汗”条件，因素水平见表1。

表1 续断“发汗”正交试验设计因素与水平（±s,n=3）

表1 续断“发汗”正交试验设计因素与水平（±s,n=3）

2.4 正交试验结果

称取续断段，按表2 中各实验序号对应的相对含水量、温度及时间进行“发汗”，按2.1 项下方法测定川续断皂苷Ⅵ的含量；极差分析可知，3 个因素对续断“发汗”加工的影响为B＞A＞C，续断优选“发汗”条件为A2B1C2，即45 ℃烘至相对含水量为（40±5）%时，在25 ℃环境下“发汗”72 h。结果见表2。

表2 不同“发汗”条件下川续断皂苷Ⅵ含量结果

2.5 续断“发汗”前后川续断皂苷Ⅵ含量及样品断面颜色测定

2.5.1 续断“发汗”前后川续断皂苷Ⅵ含量测定 基于优选的“发汗”条件进行样品处理，按2.1 项下方法测定对应样品“发汗”前后川续断皂苷Ⅵ质量分数，发现续断“发汗”后川续断皂苷Ⅵ质量分数为8.29%～10.54%，而“发汗”前质量分数为5.23%～7.64%，表明“发汗”后川续断皂苷Ⅵ含量显著升高（P＜0.05，表3）。

2.5.2 续断“发汗”前后样品颜色测定 通过优选的“发汗”条件平行“发汗”处理10 批样品，采用数码相机与计算机图像技术对续断“发汗”前后的皮部断面颜色进行数字化表征[8-9].从每批样品中随机选取3 份续断，在每份续断样品皮部的同一部位采集图像，建立续断图库。在Photoshop 打开续断图像，选择工具栏中的“窗口”菜单下的“信息”命令，在颜色模型中选择L*（代表颜色明暗）、a*（代表颜色红绿色度）、b*（代表颜色黄蓝色度）模型，读取每组续断图像中的L*、a*、b*值，计平均值。

2.5.3 续断“发汗”前后样品断面颜色测定结果根据10批样品“发汗”前后的色差值发现，10批样品“发汗”前后的断面皮部颜色具有差异。进一步比较续断“发汗”前后的颜色参数值（表3），发现“发汗”后L*值减小，b*值增大，导致续断断面颜色加深；且L*及b*值在“发汗”前后差异有统计学意义（双尾检测概率P＜0.05），而a*值在“发汗”前后差异不明显，表明亮度和黄蓝度差异是造成续断“发汗”前后断面皮部颜色差异的主要原因。

表3 续断“发汗”前后颜色值及川续断皂苷Ⅵ质量分数

2.6 相关性分析

续断经优选出的“发汗”条件处理后，川续断皂苷Ⅵ含量相对“发汗”前升高，续断断面颜色较“发汗”前加深。将续断“发汗”前后的有效成分川续断皂苷Ⅵ含量与颜色指标L*、a*、b*相关联，用SPSS 21.0 软件进行相关性分析，结果见表4。续断“发汗”前川续断皂苷Ⅵ含量与L*、a*、b*的相关系数（r）分别为0.602、0.107、0.195；“发汗”后川续断皂苷Ⅵ含量与L*、a*、b*的r分别为0.573、0.102、-0.118，两者P值均大于0.05，则川续断皂苷Ⅵ含量与续断“发汗”前后L*、a*、b*相关性不显著，表明在一定程度上续断断面颜色变化与川续断皂苷Ⅵ含量变化无直接联系。

表4 续断“发汗”前后川续断皂苷Ⅵ含量与L*、a*、b*相关性(n=10)

3 讨论

历版《中华人民共和国药典》规定，续断药材需“发汗”加工，但影响“发汗”加工效果的因素并未研究。本研究通过预试验，拟定了3 个与“发汗”效果相关的影响因素（样品相对含水量、发汗时间、发汗温度），以川续断皂苷Ⅵ含量为评价指标，利用正交试验设计探讨上述3 个因素对“发汗”效果的影响，同时建立了续断的“发汗”条件：续断鲜品45 ℃烘至样品相对含水量为（40±5）%，25 ℃环境下“发汗”72 h。极差分析结果显示，发汗温度对样品中川续断皂苷Ⅵ含量的影响最大。这可能与温度导致“发汗”过程中的酶促反应及微生物活动发生变化，促进其外观性状及内在品质变化有关[10-11]。以往研究关于“发汗”对续断颜色的影响都是文字描述，未进行量化比较，本研究结合数码相机和计算机图像技术的方法对续断颜色进行数字化表征，同时将“发汗”前后续断药材断面颜色与川续断皂苷Ⅵ含量进行了相关性分析，发现两者并不具有显著相关性，推测断面颜色变化不是川续断皂苷Ⅵ含量变化导致的，可能与“发汗”过程中的其他化学成分变化有关。龚安慧[12]对续断进行“发汗”处理后也发现，川续断皂苷Ⅵ含量升高，同时还发现总皂苷、续断苷A、续断苷B 含量降低，续断断面皮部墨绿色或黄棕色，并对色泽与化合物含量变化进行了相关性分析，结果表明，“发汗”前后色泽差异与续断苷A、续断苷B 及续断总皂苷含量的差异具有显著相关性。在其他药材“发汗”研究中也表明，环烯醚萜类成分能发生一系列的氧化、聚合、转化等化学反应，导致稳定呈色物质的产生[13]。以上研究暗示可从环烯醚萜类成分着手分析续断“发汗”前后颜色变化。

本研究采用数码相机和计算机图像技术对续断药材颜色进行数字化表征，并与续断所含成分的含量进行关联分析的方法，为续断“发汗”颜色变化机制提供了思路，为需要“发汗”工艺的药材建立质量评价体系提供参考。