基于网络药理学和生物信息学的旋覆代赭汤治疗胃食管反流病的作用机制研究

杜佳雪，刘绍能

1.中国中医科学院 广安门医院，北京 100053；

2.北京中医药大学，北京 100029

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）指胃内容物反流入食管，引起不适症状和（或）并发症的一种疾病[1]。目前，GERD 主要分为非糜烂性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）三大临床类型。典型和常见的GERD 症状为烧心和反流，其他少见或不典型的相关症状包括上腹痛、上腹不适、胸痛、嗳气、腹胀、咽部异物感、吞咽痛、吞咽困难等，此外还有食管外症状，如慢性咳嗽、咽喉炎、哮喘等[2]。GERD 在中医中应归属于“吐酸”“呕苦”“吞酸”“嘈杂”“食管瘅”等范畴，主要证型有肝胃郁热证、胆热犯胃证、气郁痰阻证、瘀血阻络证、中虚气逆证、脾虚湿热证。

旋覆代赭汤首载于《伤寒论·辨太阳病脉证并治》：“伤寒发汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫气不除者，旋覆代赭汤主之。”[3]旋覆代赭汤为和胃降逆法的代表方剂，方中旋覆花、代赭石下气降逆、消痰止呕，半夏、生姜助其散结降逆、止呕化痰之效，人参、大枣、甘草益气和中，全方升降相因，共奏和胃降逆、调理脾胃升降之功[4]。现代药理学研究表明，旋覆代赭汤具有抗炎、保护食管黏膜、促进胃动力、抑制胃酸分泌、抗胃溃疡、镇吐等作用。因此广泛用于治疗消化系统疾病，如反流性食管炎、反流性胃炎、功能性消化不良、顽固性呃逆、食管癌、反流性咳嗽、反流性喉炎等[5-6]。旋覆代赭汤主治“心下痞硬，噫气不除”之证。动物实验显示，旋覆代赭汤对胃黏膜具有明显的保护和修复作用，其作用机制可能与阻滞H2受体，抑制组胺对胃酸分泌的影响有关[7]。临床观察表明，旋覆代赭汤治疗GERD疗效显著，能够有效改善中医证候、改善患者食管动力、改善患者胃黏膜组织，值得广泛推广[8-9]。

网络药理学是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合地分析药物对疾病网络的干预与影响，揭示药物多分子协同作用于人体的机制[10-11]，与中医学的整体观念和中药及其复方多成分、多靶点、多途径协同作用的原理相符[12]。生物信息学主要研究生物系统中的信息现象、信息流及其相互作用和调控规律[13]。本研究基于旋覆代赭汤多成分、多靶点、多途径作用的研究思路，使用网络药理学和生物信息学技术，分析GERD 的差异表达基因，构建旋覆代赭汤治疗GERD 的化合物-靶点-疾病网络，初步阐述旋覆代赭汤治疗GERD 的作用机制，为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 旋覆代赭汤活性成分的筛选及靶点预测

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索旋覆代赭汤的化合物成分，根据口服利用度（oral availability，OB）≥30% 且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 筛选药物活性成分，并收集其预测靶点。基于TCMID 数据库（http://www.megabionet.org/tcmid/）和BATMAN 数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索旋覆代赭汤药物的活性成分，并设置阈值Score≥20。运用STITCH 数据库（http://stitch.embl.de/）预测旋覆代赭汤活性成分的潜在靶点。通过STRING数据库（https://string-db.org）检索收集的药物靶点蛋白，设置物种为人（homo sapiens），获取靶点蛋白的官方名称并筛除非人类蛋白。

1.2 GERD靶点的收集

在GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载GSE9768 数据集，该数据集由利兹大学分子流行病学实验室使用GPL570 平台测序，将Barrett 食管细胞系暴露于酸性环境（pH 4.5）中，分别在2、6 h 提取RNA，包括5 个2 h 提取的样本和6 个6 h 提取的样本。利用Perl 语言对数据集基因进行注释，利用R语言中limma包对数据集进行差异分析，设置阈值 Fold Change≥2，P＜0.05。从GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）上检索关键词“gastroesophageal reflux”，收集疾病靶点，将GSE9768 数据集的差异表达基因与数据库收集的疾病靶点合并去重后作为GERD的疾病靶点。

1.3 靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与分析

对药物靶点和疾病靶点取交集后，将交集靶点导入STRING 数据库进行靶点PPI 分析，设置置信度为最高（0.9）。基于从STRING数据库获得的蛋白间相互作用关系，在Cytoscape 3.7.2软件中构建靶点PPI网络，使用CytoNCA插件对网络进行拓扑学分析，设置拓扑参数阈值为介度中心性（degree centrality，DC）中位数2 倍值、介度中心性（betweenness centrality，BC）中位数、紧密中心性（closeness centrality，CC）中位数，筛选满足上述参数的靶点蛋白作为旋覆代赭汤治疗GERD的关键靶点。

1.4 化合物-关键靶点-疾病网络的构建与分析

在Cytoscape 3.7.2 软件中构建化合物-关键靶点-疾病网络，使用CytoNCA 插件对网络进行拓扑学分析，设置拓扑参数阈值为DC 中位数2 倍值、BC中位数、CC 中位数，筛选满足上述参数的活性成分作为旋覆代赭汤治疗GERD的关键药效分子。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID 数据库对交集靶点进行GO 富集分析，利用Bioconductor 中的R 包clusterprofile 对交集靶点进行KEGG 通路富集分析，设置阈值P＜0.05，根据富集分析结果在Cytoscape 3.7.2 软件中构建化合物-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 旋覆代赭汤的活性成分和预测靶点

利用TCMSP、TCMID、BATMAN、STITCH 数据库共收集到旋覆代赭汤382 个活性成分和2364 个潜在靶点，其中半夏包含38个活性成分，大枣包含84个活性成分，代赭石包含1 个活性成分，甘草包含152 个活性成分，人参包含104 个活性成分，生姜包含42个活性成分，旋覆花包含30个活性成分。

2.2 GERD靶点

对GSE9768数据集进行差异分析，共得到1549个差异基因，见图1～2。通过GeneCards、TTD、DisGeNET数据库共收集到2996 个疾病靶点，与差异基因合并去重后共收集到4371个GERD的疾病靶点。

图1 GSE9768数据集差异基因分析热图

图2 GSE9768数据集差异分析火山图

2.3 靶点蛋白PPI网络

旋覆代赭汤靶点和GERD 疾病靶点的816 个交集靶点PPI 网络及经过筛选后的关键靶点PPI 网络如图3 所示，靶点蛋白PPI 网络中共有665 个节点和3833 条边，关键靶点PPI 网络中共有204 个节点和2258条边，图3中节点直径和颜色深度与节点DC 值成正比。网络的拓扑学分析结果如表1 所示，网络DC 中位数2 倍值为14，BC 中位数为297.122 62，CC 中位数为0.032 832 28，据此筛选出164 个关键靶点，其中DC最大的6个靶点为E1A结合蛋白P300（EP300，88）、磷脂酰肌醇3-激酶CA（PIK3CA，86）、肿瘤蛋白p53（TP53，80）、蛋白激酶B1（Akt1，71）、CREB 结合蛋白（CREBBP，72）、信号传导及转录激活蛋白3（STAT3，71）。

表1 旋覆代赭汤治疗GERD靶点蛋白PPI网络部分拓扑学分析

图3 旋覆代赭汤治疗GERD靶点蛋白PPI网络及经过筛选后的关键靶点PPI网络

2.4 化合物-关键靶点-疾病网络

旋覆代赭汤治疗GERD 的化合物-关键靶点-疾病网络如图4 所示，网络共有476 个节点和2385 条边，包括1 个疾病节点、7 个药物节点、304 个化合物节点、164 个关键靶点节点。网络DC 中位数2 倍值为12，BC 中位数为109.961 202 5，CC 中位数为0.360 396 4，据此筛选出36个关键药效分子（表2）。其中DC 值较高的有白桦脂醇、水菖蒲酮、槲皮素、姜酮、3-甲基-6，7，8-三氢吡咯[1,2-A]嘧啶-2-酮、三磷酸腺苷、延胡索乙素、葫芦巴碱、β-谷甾醇。

表2 旋覆代赭汤治疗GERD的关键药效分子拓扑学参数

图4 旋覆代赭汤治疗GERD的化合物-关键靶点-疾病网络

2.5 GO富集分析和化合物-靶点-通路网络

对交集靶点进行的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，结果见图5～6。GO 富集分析共富集到生物过程（biological processes，BP）条目806 个、细胞组分（cellular component，CC）条目81 个和分子功能（molecular function，MF）条目131 个，包括细胞增殖的阳性调节（positive regulation of cell proliferation）、丝裂原活化蛋白激酶级联（MAPK cascade）、血管生成（angiogenesis）、炎症反应（inflammatory response）、细胞因子活动（cytokine activity）等。KEGG 通路富集分析共富集到183 条通路，包括内分泌抵抗（endocrine resistance）、核转录因子-κB 信号通路（NF-κB signaling pathway）、含血清素的神经突触（serotonergic synapse）、胃酸分泌（gastric acid secretion）、FoxO 信号通路（FoxO signaling pathway）等。

图5 旋覆代赭汤治疗GERD靶点的GO富集分析

旋覆代赭汤治疗GERD 的化合物-靶点-通路网络如图7 所示，网络中共有647 个节点和5295 边，包括7 个药物节点、284 个化合物节点、156 个关键靶点节点、183 个通路节点。根据网络显示，旋覆代赭汤通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗GERD的作用。

图6 旋覆代赭汤治疗GERD靶点的KEGG通路富集分析

图7 旋覆代赭汤治疗GERD的化合物-靶点-通路网络

3 讨论

GERD 是抗反流屏障功能减弱、食管清除能力下降等引起的反酸、烧心[14-15]。近年来，随着生活方式的改变，GERD 的发病率呈逐渐升高趋势[16]，在我国患病率约12.5%[17]。中医药治疗GERD的临床疗效确定、价格低廉、复发率低[18]，具有一定的特色和优势。旋覆代赭汤出自《伤寒论》，主要功效为和胃降逆、下气消痰，主治胃虚痰阻、气逆不降之证，对于GERD具有一定的临床疗效。

化合物-关键靶点-疾病网络拓扑学分析结果显示，白桦脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫芦巴碱等活性成分DC值较高，作用靶点较多，可能在旋覆代赭汤治疗GERD 的过程中发挥重要作用。动物实验表明，GERD 的发生并不是从食管的化学性损伤开始的，而是由于深层组织发生了炎症和免疫反应，导致表面组织发生了损伤[19]。白桦脂醇是一种三萜类化合物，Laavola 等[20]研究发现，白桦脂醇及其衍生物能够选择性地抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，还可抑制细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、环氧化酶-2（COX-2）等炎症因子的表达。延胡索乙素是一种生物碱，李毓等[21]研究表明，延胡索乙素能明显抑制胃黏膜基础胃酸分泌，被壁细胞摄取后可能进入泌酸小管，通过降低质子梯度而影响壁细胞的泌酸功能。Yoshinari 等[22]研究表明，饮食中添加葫芦巴碱可以抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）形成，使得血红蛋白糖化和脂质积累，下调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和线粒体电子传递系统的基因表达，葫芦巴碱能够抑制或减缓机体的氧化应激。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，具有良好的抗癌[23]、抗炎[24]、抗氧化[25]活性，可以抑制由炎症因子脂多糖所引起的中性粒细胞自发性凋亡的延迟，同时槲皮素也可降低中性粒细胞对炎症因子的敏感性，从而达到抗炎的目的[26]。Butt 等[27]的研究发现，姜酮等香料类生物活性物质的高抗氧化活性可以在细胞水平上激发自由基清除能力，从而缓解各种代谢综合征，此外，香料类生物活性物质能够增强免疫和减少炎症。

对靶点蛋白PPI 网络的分析显示，EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3 等靶点蛋白DC 值较高，意味着这些蛋白与其他蛋白作用较多，可能在旋覆代赭汤治疗GERD 的过程中发挥重要作用。EP300 和CREBBP 是属于KAT3 家族的组蛋白/蛋白赖氨酸乙酰转移酶，其作为转录活化因子能够通过修饰组蛋白和非组蛋白核蛋白的赖氨酸残基，增强转录[28]。CREBBP 和EP300的失活突变会导致基因组整体乙酰化水平降低和基因调控异常，潜在的促进了肿瘤的发生[29]。TP53作为与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，一直以来受到广泛的关注。TP53基因编码蛋白质为p53，作为转录因子，p53 诱导下游蛋白p21、BAX 和GADD4 等表达，在细胞凋亡、周期变化、DNA 修复、细胞代谢及自噬过程中都起着重要的作用[30-32]。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[33]。PIK3CA基因属于原癌基因的一种，可表达于正常的人体组织中，通常不易被检测到，在正常细胞中起调节细胞增殖、分化和凋亡等作用，在突变时可呈过度表达，促使PI3K 催化活性增强及蛋白合成量增加，激活下游靶点Akt。激活后的Akt 具有生物活性，能持续刺激下游一系列靶蛋白，从而抑制凋亡基因的表达，引起细胞周期变短，从而导致肿瘤发生[34]。STAT3 可通过介导炎症介质的细胞外信号调控肿瘤细胞、免疫细胞等的生物学行为，是慢性炎症促进肿瘤发生及肿瘤相关性炎症形成过程中不可或缺的关键性分子[35]。此外，近期有研究报道，瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）能够直接或间接参与多种消化道疾病的病理生理过程，如疼痛发生、内脏高敏感性、炎症反应等，GERD 患者食管黏膜TRPV1 表达量增加，且与患者的症状积分相关，提示TRPV1 受体在GERD 患者症状的产生中起着重要的作用[36-37]。本研究发现，麻黄碱、甘草次酸、甘草萜醇、桦木酸等活性成分均能够作用于TRPV1，可能是旋覆代赭汤治疗GERD的重要机制之一。

GO 富集分析结果显示，旋覆代赭汤对GERD 的治疗作用可能主要通过调节细胞增殖、凋亡、周期等，涉及氧化应激反应、血管生成、炎症反应、细胞因子活动等。KEGG 通路富集分析结果主要包括内分泌抵抗、NF-κB 信号通路、含血清素的神经突触、胃酸分泌、FoxO 信号通路等。Nomura 等[38]研究发现，代谢综合征和肥胖是已知的GERD 危险因素，常在甲状腺功能障碍和垂体功能减退等内分泌疾病患者中发现。5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）是调节胃肠道运动、分泌及感觉功能的重要神经递质，90%存在于消化道黏膜[39]。崔秀芳等[40]临床研究表明，胃食管反流病患者中5-HT 水平较高，且5-HT 水平与患者腹痛有关。张婷[41]研究发现，5-HT通过作用于5-HT4R，对离体食管黏膜肌条具有舒张作用，对于离体食管下括约肌条具有收缩作用。NF-κB 是一类关键性的核转录因子，与免疫细胞的活化、炎性分子转录的调控、T 和B 淋巴细胞的发育、细胞凋亡、应激性反应等有关[42]。FoxO 家族是转录调节因子，其上游受PI3K/PKB 磷酸化级联通路的调节，下游调节的靶基因多与细胞周期、细胞凋亡、衰老及代谢有关，FoxO 的磷酸化/非磷酸化状态与转录调节功能有密切关系[43]。由于FoxO 的促凋亡和抗增殖作用，其被认为是肿瘤抑制因子，在抗肿瘤中起着至关重要的作用[44-45]。

综上所述，本研究基于中药多成分、多靶点、多途径作用的研究思路，以生物信息学及网络药理学为基础，筛选出Barrett 食管细胞系接触胆汁酸不同时间的差异基因，构建了化合物-关键靶点-疾病网络、靶点PPI网络和化合物-靶点-通路网络，对关键药效分子和关键靶点进行了分析。研究发现，旋覆代赭汤中的白桦脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫芦巴碱等活性成分，能够作用于EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3、TRPV1等靶点，通过调节细胞增殖、细胞凋亡、氧化应激反应、炎症反应、细胞因子活动、胃酸分泌、胃肠道运动等生物过程达到治疗GERD 的目的。本研究初步阐述了旋覆代赭汤治疗GERD 的作用机制，为后续研究提供了参考。但中药的化合物成分及潜在靶点并未全部录入，因此诸多机制尚待实验研究验证。