基于网络药理学的八珍汤治疗手术后贫血作用机制研究

韩铮，蒋科卫，赵秉元，李润民，邰耀

1.北京中医药大学，北京 100029；

2.中国中医科学院 望京医院 骨关节二科，北京 100102

贫血（anemia）是大型手术后较常见的症状，世界卫生组织定义贫血的诊断为成年男性血红蛋白（HGB）＜130 g·L-1，成年女性HGB＜120 g·L-1。中国围手术期血液管理研究发现，关节置换术后贫血发生率达80%以上[1]，脊柱手术后贫血平均发生率同样高达80%[2]。术后贫血（postoperative anemia）发生的主要原因包括3点：1）手术中失血量过大；2）术后营养摄入不足；3）术前贫血[3]。西医对贫血的治疗以应用氨甲环酸注射液、自体血液回输、异体输血、营养支持为主要手段[4-7]。随着中医药的发展，中药参与术后贫血的治疗越来越多。术后贫血符合中医学中“虚劳-血虚”的特点。八珍汤出自《瑞竹堂经验方》，是中医治疗气血亏虚的经验名方，由人参、白术、茯苓、甘草、熟地黄、当归、白芍、川芎8 味药物组成。徐凯捷等[8]在临床观察中发现，加味八珍汤可以提高类风湿性关节炎患者关节置换后的血红蛋白含量及消除下肢肿胀。文献研究表明，八珍汤可以改善股骨近端髓内钉（PFNA）术后贫血，提高血红蛋白及红细胞比容[9]，治疗癌性贫血[10]及肾性贫血[11]。但目前对于八珍汤治疗术后贫血的作用机制研究少有报道。本研究通过网络药理学筛选八珍汤中药物的有效成分，构建“疾病-靶点-成分”网络，寻找八珍汤治疗术后贫血的主要蛋白及通路，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 八珍汤各成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[12]分别检索八珍汤中8味药物人参、白术、茯苓、甘草、熟地黄、当归、白芍、川芎的有效化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18进行成分筛选。将筛选出的有效化学成分与UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）中蛋白质进行匹配，得到八珍汤化学成分可能的靶点蛋白及基因。

1.2 术后贫血相关靶点筛选

以“postoperative anemia”为关键词分别检索GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）、OMIM 数据库（http://www.omim.org）、TTD 数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd），进行疾病相关基因的查询与靶点预测，将全部数据录入Excel表格中整理，删除重复值，确定最终疾病靶点信息。

1.3 药物疾病共同靶点预测

利用Venny 软件将八珍汤成分靶点和术后贫血靶点取交集，得到共同作用靶点，使用绘图软件Cytoscape 3.7.0 构建疾病-药物-成分-靶点网络图，将结果进行可视化处理。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与关键靶点筛选

利用STRING 11.0 网络平台（https://string-db.org）[13]构建共同作用靶点的PPI 网络。将Organism设置为Homo sapiens 进行网络构图，最低相互作用阀值设置为0.4，隐藏游离靶点，确保数据真实可靠。将数据结果分别以TSV 和PNG 格式导出。应用Perl脚本得到核心靶蛋白。

1.5 基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路构建

运用R 3.6.3 对疾病与药物共有靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路构建分析，设置P＜0.05，得到显著通路图。

2 结果

2.1 八珍汤有效成分

通过TCMSP 检索符合OB 值和DL 值的有效成分，获得八珍汤有效成分共160个，其中人参22个、白术7 个、茯苓15 个、当归2 个、川芎7 个、白芍13 个、熟地黄2 个、甘草92 个，删除重复项后最终获得符合条件的有效化学成分150 个，其中DL 值排名前20位的有效化学成分见表1。

表1 八珍汤活性成分（DL值排名前20位）

2.2 八珍汤与术后贫血共同作用靶点

将八珍汤150 个有效成分与UniProt 数据库进行匹配，得到相关蛋白基因数据，其中熟地黄29 个、人参193 个、甘草1255 个、茯苓22 个、当归52 个、川芎31 个、白术18 个、白芍61 个，删除重复靶点后最终获得八珍汤有效成分靶点216 个。通过GeneCards、OMIM、TTD 数据库进行搜索，删除重复靶点后获得“postoperative anemia”相关基因靶点共1832 个。通过Venny 绘图软件得到疾病与药物共同作用靶点，如图1所示，其中包括一氧化氮合酶2（NOS2）、雌激素受体1（ESR1）、雌激素受体2（ESR2）、前列腺素内过氧化物合成酶1（PTGS1）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）等。

图1 八珍汤-术后贫血相关靶点韦恩图

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络

运用Cytoscape 3.7.0 软件将获得的共同作用靶点绘制八珍汤治疗术后贫血的疾病-靶点-成分网络图（图2）。根据网络拓扑属性，度（degree）值越大，表明经过该结点连线越多。分析结果表明，度值较高的前10个靶点依次为PTGS2、ESR1、雄激素受体（AR）、NOS2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、糖原合成酶激酶3（GSK3B）、ESR2、结缔组织生长因子（CCN2）、钠通道、电压阀门Vα（SCN5A）。有效成分中度值排名前5 的依次为槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查耳酮a、7-甲氧基-2-甲基异黄酮。

图2 八珍汤治疗术后贫血的疾病-靶点-成分网络

2.4 PPI网络构建

通过STRING 11.0 在线软件，导入术后贫血与八珍汤的共同作用靶点，将medium confidence 设置为0.4，隐藏去除游离靶点，最终得到140 个节点、2625 条边的PPI 网络，节点平均度值为37.5。将图片以PNG 格式导出，见图3。数据以TSV 格式储存，应用R 语言脚本对所得数据进行分析统计，相邻节点数排名前20 位的靶点见图4。结果表明，八珍汤可能通过作用于蛋白激酶B1（Akt1）、白细胞介素-6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）等蛋白改善术后贫血。

图3 八珍汤治疗术后贫血PPI网络

图4 八珍汤治疗术后贫血PPI网络核心蛋白

2.5 GO功能分析

GO 富集结果显示，八珍汤治疗术后贫血的可能作用过程有152 条，包括影响细胞因子受体结合、受体配体活性、DNA-RNA 转录过程、血红素结合、蛋白激酶调节活性、血小板衍生生长因子结合等。富集基因显著性排名前20位的GO富集条目见图5。

图5 八珍汤治疗术后贫血GO富集分析

2.6 KEGG通路分析

KEGG 分析最终得到168条可能通路，包括晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 信号通路、MAPK信号通路、细胞衰老、细胞凋亡、C型凝集素受体信号通路、IL-17 信号通路、Janus 激酶/信号转导子和转录激活子（JAK-STAT）信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路、造血细胞系、癌症中的microRNAs、前列腺癌、甲型流感、EB（epstein-barr）病毒感染、人乳头瘤病毒感染、内分泌抵抗、麻疹等。按基因富集显著性排名前20 位的通路见图6。

图6 八珍汤治疗术后贫血KEGG通路分析

3 讨论

术后贫血的发生是术后并发症出现的高危因素，可导致术后感染率和死亡率升高[14-15]，影响患者肢体功能活动[16]及术后生活质量[17]等。中医学认为，手术创伤造成血溢脉外、气随血脱，导致术后患者少气懒言、食欲不振、面色恍白、脉虚弱等症状。八珍汤由四物汤和四君子汤组合而成，具有健脾益气、补血等功效。方中人参和熟地黄共为君药，具有益气养血的功效；茯苓和白术为臣药，健脾益气；当归和白芍补血和营；川芎为佐药，行气活血；甘草为使药，调和全方。诸药合奏，达到补而不腻的功效。甘锋平等[18]的临床研究结果表明，老年患者髋关节置换术后口服八珍汤，其血液中血红蛋白、人血清白蛋白与对照组有明显差异。王官林等[19]研究发现，八珍汤可有效提高老年患者术后红细胞和血红蛋白指标。高依卿等[20]研究发现，八珍汤可促进大鼠和小鼠脾淋巴细胞产生集落因子（CSFs），从而改善血液指标。陈玉春等[21]研究表明，八珍汤可提高小鼠血清促红细胞生成素（EPO）水平，可能通过此种方式增加造血。

本研究结果显示，根据OB、DL 值筛选出八珍汤活性成分相关靶点216 个，术后贫血相关靶点140 个。八珍汤中可能与术后贫血相关的有效成分为槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查耳酮a 等。相关研究显示，槲皮素可促进大鼠肾脏生成和释放EPO，从而改善贫血[22]。山柰酚具有抗癌、抗氧化、抗骨质疏松、保护损伤组织、参与免疫调节等作用[23]，对术后恢复具有一定促进作用。柚皮素具有抗血小板聚集作用[24]，有一定的抗血栓功效。甘草查耳酮a 具有抗癌、抗炎、抑菌、抗氧化等作用[25]。此结果表明，八珍汤可从多种途径改善术后贫血，可降低术后并发症的发生率。PPI网络显示，Akt1[26]、IL-6[27]、VEGFA[27-28]、MAPK[29]等都具有与贫血相关联的表达。八珍汤可能通过调节Akt1、IL-6 的表达调节造血细胞的增殖、分化和凋亡；通过调节VEGFA表达促进血管内皮细胞的分化和凋亡，进而改善贫血。同时部分基因也与肿瘤表达相关联，表明八珍汤在治疗肿瘤方面具有一定的潜能。

GO 功能富集结果显示，八珍汤具有改善受体配体活性的功能，同时也有促进血色素结合的功能。KEGG 通路富集发现，这些作用与MAPK、PI3K-Akt通路相关。目前研究发现，MAPK 通路存在细胞外调节蛋白激酶（ERK）、ERK5、NK、p38/MAPK 分支路线，前两者参与细胞的生长和分化，为机体提供营养支持，后2 种分支路线可抑制炎症反应和细胞的凋亡[30]。AGE-RAGE 通路与创面愈合修复相关，涉及多种细胞因子[31]。PI3K-Akt 通路可参与多种生物进程，其持续的活化可导致白细胞的持续增生[32]，表明八珍汤可能通过该通路提高机体免疫力。同时也有研究显示，该条通路可调节促红细胞增殖内皮祖细胞，降低内皮祖细胞的凋亡[33]。同时KEGG 研究发现多条与肿瘤相关通路，与PPI 网络分析相互结合，说明八珍汤在抗肿瘤方面有一定的潜力。从中医学角度分析，肿瘤的临床表现与术后贫血类似，均存在正气不足、体质虚弱，在治疗原则上具有类似的治法。此结果也表明，中药具有异病同治的特点。在白芍治疗贫血的作用机制研究中发现，负调控脂质存储可能为白芍治疗贫血的关键通路，细胞-神经网络可能为关键途径；KEGG 研究发现，IL-17通路、AGE-RACE 通路、TNF 通路可能为关键通路[34]，说明白芍与八珍汤治疗贫血存在相似之处。

本研究结果表明，八珍汤可通过多种成分作用于多途径，发挥治疗术后贫血的作用。但目前网络药理学研究只能分别对药物有效成分进行研究分析，在对于中药煎煮时高温加热导致部分蛋白变性及中药之间可能发生的相互化学反应暂时无法预测。在今后的研究中仍需要进一步完善。