乳腺癌中Cyclin D1和TGF-β1蛋白表达及其临床意义

嵇晓辉，李军，杨金花

(河南中医药大学人民医院/郑州人民医院 病理科，河南 郑州 450003)

乳腺癌是一种多病因、高风险、多途径发生的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。近年来随着医药发展及靶向治疗的飞速发展，乳腺癌的治疗方法也逐步由传统的手术切除及放化疗向精准治疗方向发展[1-2]。细胞周期蛋白(Cyclins)是细胞癌变过程中重要的调控因子，通过与相应的蛋白激酶结合来调节酶活性，从而影响细胞分裂周期。Cyclin D1定位于染色体11q13，是G1期正向细胞周期蛋白，驱动G1期进入S期，加快细胞周期进程，促进细胞增殖分化及肿瘤的发生发展[3]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一个多效的生物因子，定位于染色体19q13，广泛参与细胞的增殖、分化及凋亡等多种病理生理过程。目前研究认为TGF-β1在肿瘤发生初期起抑制肿瘤作用，但在细胞恶变或肿瘤晚期过程中，其通过促肿瘤血管生成、抑制肿瘤免疫，而促进肿瘤浸润转移[4-5]。本研究采用免疫组化Max Vision法检测Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌组织中的表达，并分析二者与乳腺癌临床病理特征的关系，探讨二者对乳腺癌发展转移及预后的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集河南中医药大学人民医院病理科2017年6月至2019年8月存档的组织活检标本，包括86例乳腺癌、60例正常乳腺组织和60例乳腺良性增生组织，所有标本均经病理科确诊。患者均为女性，平均年龄为50岁，术前均未行放、化疗及生物免疫治疗。标本经中性甲醛固定后石蜡包埋，切片厚度4 μm。

1.2 检测方法鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体和兔抗人TGF-β1多克隆抗体(即用型)、二抗及DAB均购自福州迈新公司。免疫组化采用Max Vision法，常规石蜡制片后，进行抗原修复，一抗和二抗分别于37 ℃孵育2 h和20～30 min，DAB显色10 min，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断Cyclin D1蛋白以细胞核、TGF-β1蛋白以胞质内出现清晰棕黄色颗粒为阳性，每张选取5个高倍镜视野。计分标准如下。(1)按细胞阳性率计分。阳性细胞率<5%为0，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。(2)按细胞染色强度计分。细胞未染色为0，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分结果相乘>2分为阳性。

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。各组间表达阳性率采用χ2检验，对相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyclin D1和TGF-β1在正常乳腺组织、乳腺良性增生及乳腺癌组织中的表达Cyclin D1在正常乳腺组织、乳腺良性增生及乳腺癌组织中的阳性率分别为46.67%(28/60)、31.67%(19/60)及69.77%(60/86)；TGF-β1在正常乳腺组织、乳腺良性增生及乳腺癌组织中的阳性率分别为48.33%(29/60)、41.67%(25/60)及79.07%(68/86)。采用χ2检验两两比较，二者在乳腺癌组织中的表达均高于正常乳腺组织和乳腺良性增生组织，差异有统计学意义(P<0.05)；二者在正常乳腺组织和乳腺良性增生组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1、2。

表1 Cyclin D1和TGF-β1在正常乳腺组织、乳腺良性增生和乳腺癌组织中的表达[n(%)]

2.2 Cyclin D1和TGF-β1表达与乳腺癌临床病理特征的关系Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌伴淋巴结转移的原发灶中的表达高于不伴有淋巴结转移的原发灶，差异有统计学意义(P<0.05)；与乳腺癌临床分期呈正相关(P<0.05)；与患者年龄、绝经状态、肿瘤直径、组织学类型及组织学分级无关(P>0.05)。见表2。

表2 Cyclin D1和TGF-β1蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

图2 TGF-β1在乳腺癌细胞质中的表达(Max Vision法，×100)

2.3 Cyclin D1与TGF-β1表达的相关性在60例Cyclin D1表达阳性的乳腺癌组织中，有53例患者TGF-β1表达阳性，经Spearman等级相关性分析，乳腺癌组织中Cyclin D1蛋白表达强度和TGF-β1蛋白表达呈正相关性(r=0.385，P<0.05)。

3 讨论

Cyclin D1作为细胞周期调控基因，也是一个癌基因，其参与细胞周期中DNA的合成，其表达升高可以导致肿瘤细胞有丝分裂的G1/S期进程加快，使细胞分裂失去控制，从而发生恶变。Mauro等[6]研究显示了乳腺癌细胞中的雌激素水平状态可以影响Cyclin D1蛋白的表达，这个结果间接表明了乳腺癌中雌激素蛋白的表达与Cyclin D1之间可能存在着某种关联性，此在后来的研究中[7]也得到证实。Cyclin D1与雌激素的密切关系也预示了乳腺癌患者的病情发展及预后评估。有研究显示Cyclin D1在肿瘤早期组织中的表达较高，这似乎提示了良好的预后与Cyclin D1的高表达呈正相关性[8]。然而，韩涛等[9]在分析了Cyclin D1在三阴性乳腺癌中的表达情况后发现，Cyclin D1在临床分期较高的晚期乳腺癌患者中的表达水平远远高于早期乳腺癌患者，而且患者的5 a生存率也大大降低。此项研究却表明Cyclin D1的表达与三阴性乳腺癌的预后呈明显负相关性。近年来，关于Cyclin D1与其他恶性肿瘤的关系也时有研究报道。在本研究中，86例乳腺癌组织中，有60例Cyclin D1表达呈阳性，阳性表达率为69.77%，远高于其在正常乳腺组织(46.67%)及乳腺良性增生组织(31.67%)中的表达阳性率，而且随着淋巴结转移的发生及临床分期的进展，Cyclin D1表达也明显升高，但其表达阳性率与患者的年龄、绝经状态与否、肿瘤直径大小以及组织学分类及分级均无相关性。这提示了Cyclin D1与乳腺癌的进展和远处转移具有显著正相关性，提示Cyclin D1与乳腺癌患者的不良预后有关。

TGF-β1属于TGF-β超家族，目前认为TGF-β1在肿瘤的发生和发展过程中具有两面性，对于正常或早期肿瘤细胞而言，它可以使细胞阻滞在细胞有丝分裂G1期或者延长从G0期进入S期的时间；但在肿瘤晚期进展过程中，由于信号通路的异常改变，TGF-β1却可增强肿瘤细胞侵袭转移的能力，促使肿瘤浸润转移[10]。有体外研究表明，一定水平的TGF-β1可通过经典的Wnt信号通路促使肝癌细胞上皮间质转化，从而增强肝癌细胞的增殖、浸润和转移能力[11]。本研究中，TGF-β1在乳腺癌组织中的表达阳性率为79.07%，远远高于正常乳腺及乳腺良性增生组织，差异有统计学意义。同时，本研究显示TGF-β1阳性表达率与患者淋巴结转移及TNM分期呈相关性，与患者年龄、绝经状态、肿瘤直径大小及组织学分类分级无相关性，这表明TGF-β1可能促使乳腺癌的浸润转移，与文献报道一致。

目前针对Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌中的表达相关性的研究鲜见报道。Cyclin D1和TGF-β1均作用于细胞有丝分裂G1期，而且二者在肿瘤的早期和晚期表达水平均不一致，对预后的影响也都不相同。此前，有针对Cyclin B1与TGF-β1的研究发现二者在食管癌细胞中表达呈负相关，Cyclin B1的过表达可能使TGF-β1表达下降[12]。更有研究发现AuroraA-h-CPEB通路可能会引起Cyclin B1和CDKs的过度表达,而且Cyclin B1/CDC2复合物的高活性同时也伴有Cyclin D1的过度表达[13]。本研究结果在一定程度上提示Cyclin D1和TGF-β1之间也可能存在某种调节通路。通过相关性分析发现在乳腺癌患者中，Cyclin D1和TGF-β1蛋白表达存在正相关性，但具体的调节路径及信号通路还有待分子遗传学水平的进一步研究。

综上所述，Cyclin D1与TGF-β1在人乳腺癌组织中呈过表达，且与乳腺癌伴有淋巴结转移及乳腺癌TNM分期呈正相关性；二者的高表达可能提示与乳腺癌发展转移密切相关，二者联合检测可作为乳腺癌高转移风险及预后的判断。同时，随着精准医学的发展，越来越多的针对Cyclin D1与TGF-β1的细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂将被应用于临床研究及治疗，可使部分乳腺癌患者从靶向治疗中获益。