猪繁殖与呼吸综合征病毒污染支原体的清除

胡晓凤 王家福 尹忠良 康斌 李建林 李少丽

摘  要：为评价商品化支原体清除剂对猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）污染支原体的净化效果，研究首先优化了Marc145细胞耐受支原体清除剂的工作浓度，确定最适工作浓度为25 μg/mL，然后在PRRSV培养液中加入25 μg/mL的支原体清除剂，盲传3代，不加支原体清除剂继续盲传3代，将最后一代PRRSV样品及后续3代盲传样品进行支原体PCR检测，结果显示成功清除了PRRSV中的支原体，并且PRRSV病毒效价与清除前无明显差异，最终得到了无支原体的纯净PRRSV，为PRRSV相关疫苗的生产及其他细胞或病毒污染支原体的清除提供了很好的理论支撑。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒;支原体;清除

中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2021）04-0034-03

支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器且可用人工培养基培养增殖的原核生物，大小为0.1 μm～0.3 μm。细胞培养过程中污染支原体是常见问题，常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体（Acholeplasma Laidlawii），有的细胞株可同时污染两种以上支原体。当特别重要的细胞株或病毒污染支原体时，要对其清除，最常用且最简便的方法是用抗生素处理。

本研究拟清除猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）中污染的支原體，旨在保证病毒的纯净性。研究在Mar145细胞培养液中加入支原体清除剂，优化细胞耐受该试剂的工作浓度，在加入清除剂的细胞培养液中接种PRRSV，盲传6代后进行支原体PCR检测，电泳显示支原体阴性，表明PRRSV中污染的支原体得到了彻底清除。

1  试验材料

PRRSV及Marc145细胞（杭州佑本动物疫苗有限公司CNAS检测中心提供）;支原体清除剂（上海碧云天生物技术有限公司）;支原体PCR检测试剂盒（哈尔滨世纪元亨生物科技公司）;0.1 μm滤菌器（美国Millipore公司）;细胞培养瓶及培养板（美国Corning公司）;DMEM培养基（美国GIBCO公司）;胎牛血清（美国GIBCO公司）。

2  试验方法

2.1 Marc145细胞耐受支原体清除剂工作浓度的优化

用含5%胎牛血清的DMEM培养液在6孔板中培养Marc145细胞，分别加入终浓度为10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL的支原体清除剂，同时设Marc145细胞空白对照孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。按照此方法盲传3代，根据Marc145细胞的生长状态确定支原体清除剂的最适工作浓度。

2.2 PRRSV中支原体的清除

在Marc145单层细胞培养液中按照培养液体积3%～5%的比例接种PRRSV，吸附     1 h，然后加入25 μg/mL的支原体清除剂，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。盲传3代，不加支原体清除剂继续盲传3代，按照支原体PCR检测试剂盒说明书进行支原体PCR检测。

2.3 PRRSV的病毒效价测定

将最后一代盲传的PRRSV以及清除前的PRRSV分别接种96孔板，按照Reed和Muench法进行病毒效价测定。

3  试验结果

3.1 Marc145细胞耐受支原体清除剂工作浓度的优化结果

在Marc145细胞培养液中加入终浓度为12.5 μg/mL、25 μg/mL、37.5 μg/mL的支原体清除剂，培养3代后显微镜观察，可见所有孔中Marc145细胞状态正常，且各孔之间无明显差异，确定Marc145细胞耐受支原体清除剂的工作浓度范围为12.5 μg/mL～37.5 μg/mL，        考虑支原体清除剂浓度太大对细胞可能造成不易观察的细微病变，最终，将其最适浓度确定为25 μg/mL（图1）。

3.2 PRRSV中支原体的清除试验结果

将支原体清除剂按照终浓度25 μg/mL加入PRRSV培养液，盲传3代，48 h～52 h后细胞出现明显的聚堆、脱落等病变。然后不加支原体清除剂再盲传3代，最后对用支原体清除剂清除的F3代PRRSV及之后盲传的3代（F4～F6）PRRSV进行支原体PCR检测，电泳结果显示，所有检测PRRSV样品未在602 bp处出现特异性条带，表明PRRSV中支原体彻底清除（图2）。

3.3 PRRSV的病毒效价检测结果

按照Reed和Muench法检测PRRSV清除前、后的病毒效价分别为107.3 TCID50/mL和  107.5 TCID50/mL。将支原体完全清除的PRRSV做好标记，-80 ℃冻存。

4  讨论

支原体广泛存在于我们生活的环境中，一般不致病，但若在细胞培养时或者病毒分离过程中污染了支原体，则会影响细胞生长状态或病毒效价，此时需要对支原体进行清除。不同细胞对支原体清除剂的耐受浓度不同，支原体清除剂浓度太大会阻碍细胞生长，甚至影响细胞状态，而浓度太小又起不到抑制或清除效果。本试验首先优化了Marc145细胞耐受支原体清除剂的最佳工作浓度，确定细胞可以在终浓度为12.5 μg/mL～37.5 μg/mL的细胞培养液中生长，考虑支原体清除剂浓度太大对细胞可能造成不易观察到的细微病变，最终，将其最适浓度确定为25 μg/mL。另外，加入支原体清除剂或其他清除试剂后病毒至少要正常培养3代才可以检测，以便更客观评价支原体的清除效果。

采用商品化的抗生素清除支原体时，当支原体含量较高时需要加大抗生素用量或多清除几代，有时还需要使用0.1 μm滤菌器过滤以降低支原体含量。此外，支原体清除剂属于抗生素，若长期使用一种抗生素可能会使支原体产生耐药性，建议不同类清除剂交替使用。