乳酸菌发酵苹果红枣复合饮料的研制

◎ 祝睿文，张 玲，乔立红，欧阳会，冯美琴，颜玉华

（金陵科技学院 动物科学与食品工程学院，江苏 南京 210038）

苹果口感香脆，营养丰富，不仅含有丰富的维生素、矿物质、有机酸、膳食纤维、黄酮及多酚类等营养物质，能够调理肠胃、降低血压和胆固醇[1]，还含有人体所必需的多种糖类[2-3]、氨基酸、蛋白质以及矿物质[4]，具有补气益血、美容养颜、润肺止咳、健养脾胃的功能[5]。红枣有软化血管、抗癌、抑过敏[6]和预防高血压等功效。

复合发酵饮料是利用益生菌发酵后制成的产品[7]，具有广阔的市场空间和发展前景。近年来，已经出现苹果分别与番茄[8]、芦荟[9]、胡萝卜[10]以及红枣与核桃[11]、竹笋[12]等果蔬制作的复合发酵饮料，还未出现以苹果与红枣来制作复合发酵饮料。本研究以苹果、红枣为主原料，选用实验室自主筛选保藏的乳酸菌F604为发酵剂，采用单因素实验，结合响应面研究法，研制乳酸菌发酵苹果红枣复合饮料新工艺，以期为其工业化生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌F604：于金陵科技学院动物科学与技术学院食品系C102冷冻保藏。

苹果、红枣购于苏果超市；蒸馏水；牛肉膏（生物试剂），杭州百思生物技术有限公司；蛋白胨（生物试剂），上海润捷化学试剂有限公司；酵母浸粉（生物试剂），南京茂捷微生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；吐温-80、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、无水乙酸钠（均为分析纯），上海久亿化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯），南京奥佳化工有限公司；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，北京陆桥技术股份有限公司；孟加拉红琼脂、平板计数琼脂培养基，杭州滨河微生物试剂有限公司；果汁培养基（苹果汁与红枣汁体积比为7∶3）。

1.2 实验仪器

FA2104M电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、BXM-30R高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、Shj-Gj-1F超净台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、HH-3A水浴锅（常州润华电器有限公司）、SPX-3008SH-II恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、DJ12B-A11料理机（九阳股份有限公司）及PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 实验方法与工艺流程

1.3.1 菌种活化及驯化

将乳酸菌菌种以2%（V/V）接种到100 mL MRS培养基中，于30 ℃培养箱中恒温培养24 h，后以 2%（V/V）接入100 mL果汁培养基中培养18 h。

1.3.2 苹果汁的制备

选择饱满新鲜，无病虫害的苹果削皮，切成 2 cm×2 cm大小的小丁，按料水比1∶3的比例榨汁，过滤2～3次，制得苹果汁。

1.3.3 红枣汁的制备

选择色泽光亮，肉质肥厚的红枣，去核，按料水比1∶8的比例，榨汁，过滤2～3次，制得红枣汁[13]。

1.3.4 混合果汁的制备及发酵

将苹果汁和红枣汁按照一定比例混合，于85 ℃水浴锅中加热保温15 min，冷却，加入不同接种量的乳酸菌，在不同温度下发酵不同时长。

1.4 单因素实验

1.4.1 发酵果汁最适配比的确定

将苹果汁和红枣汁以5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混合，在以乳酸菌接种量为6%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为10 h的确定条件下，进行感官评定及pH的测定。

1.4.2 发酵果汁最适接种量的确定

以最佳的混合果汁比，以2%、4%、6%、8%、10%的接种量，在30 ℃条件下发酵10 h，进行感官评定及pH的测定。

1.4.3 发酵果汁最适发酵温度的确定

以最佳的混合果汁比，最佳的接种量，在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃条件下发酵10 h，进行感官评定及pH的测定。

1.4.4 发酵果汁最适发酵时间的确定

以最佳的混合果汁比，最佳接种量，最佳发酵温度为确定条件，发酵6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，进行感官评定及pH的测定。

1.5 响应面实验

根据单因素实验，选择对苹果红枣发酵果汁感官影响较大的果汁混合比例、接种量、发酵温度、发酵时间4个因素作为自变量，感官评价得分作为相应值，利用Design-Expert V8.0.6软件进行实验优化设计[14-17]，并进行验证实验。

1.6 指标检测

1.6.1 感官评定组织10名食品专业的学生，对发酵后的果汁进行感官评定。苹果红枣发酵果汁感官评定指标见表1。

表1 苹果红枣发酵果汁感官评定指标表

1.6.2 理化指标检测

pH值：使用PHS-3C pH计进行测定，参照《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》（GB/T 10468—1989）。 总酸：采用酸碱滴定法测定[18]。

1.6.3 微生物指标检测

乳酸菌检验：参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）；大肠菌群的测定：参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）；霉菌的检验：参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 最佳果汁配比的确定

由图1可知，苹果汁与红枣汁比例最好为7∶3。若红枣汁过多，则发酵果汁颜色为深红棕色，闻起来红枣味过重，完全盖过苹果汁气味，口感偏甜腻。若苹果汁过多，则发酵果汁颜色偏浅，闻起来较清淡，缺少红枣的醇厚感，口感偏淡。当比例为7∶3时，发酵果汁颜色为棕黄色，气味适中，口感较酸甜适宜，感官评分最高，为80.37。因此，苹果汁与红枣汁比例确定为7∶3。

图1 苹果汁与红枣汁比例的确定图

2.1.2 最佳接种量的确定

由图2可知，当发酵果汁接种量为6%时，感官评分最高，所以最佳接种量为6%。发酵果汁的pH随接种量的加大而呈下降趋势，这是由于一开始接种数较小，接种的菌落基数较小，繁殖较缓慢，产酸能力较弱；伴随着接种数的增加，菌落繁殖越来越快速，产酸能力也随之增加[19]。当接种量过少，则发酵不充分，口感无发酵风味；当接种量过大，则发酵过度，酸味太重，口感不协调，不适于饮用；当接种量为6%时，发酵适中，酸味适度，口感较酸甜适宜，适于饮用。所以接种量确定为6%。

图2 接种量的确定图

2.1.3 最佳发酵温度的确定

由图3可知，当发酵温度为30 ℃时，感官评分最高，所以确定30 ℃为最佳发酵温度。随着发酵温度的增加，感官评分呈先上升后下降的趋势。发酵温度低于30 ℃时，随温度的升高乳酸菌生长速度增加，发酵特有的酸味越来越明显；温度为30 ℃时，乳酸菌活性达到最好，果汁口感酸甜可口，并且具有发酵特有的风味；温度高于30 ℃时，乳酸菌过度发酵，酸味太重，果汁的风味也随之降低。因此果汁的最佳发酵温度 为30 ℃。

图3 发酵温度的确定图

2.1.4 最佳发酵时间的确定

由图4可以看出，当发酵时间为10 h时，感官评分最高，所以确定10 h为最佳发酵时间。随着发酵时间的增加，感官评分呈先上升后下降的趋势，pH值呈现一直下降的趋势，这是由于发酵前期，果汁中营养物质和糖类充分，菌种利用营养物质不断产酸，乳酸积累，pH不断下降；随着发酵时间的增加，果汁中营养物质减少，一些菌种衰老死亡，乳酸积累逐渐减少，另外果汁中前期积累的乳酸可能会抑制乳酸菌的生长，所以pH趋于不变[20]。即发酵时间低于10 h时，发酵不充分，乳酸发酵风味未完全释放；发酵高于10 h 时，发酵过度，引起发酵果汁酸败，口感酸涩，因此果汁的最佳发酵时间为10 h。

图4 发酵时间的确定图

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面实验因素

根据单因素实验，设定因素水平表，见表2。

表2 因素水平表

2.2.2 响应面实验结果

使用Design Expert V8.0.6软件进行数据处理，Box-Behnken试验设计及结果见表3，回归模型方差分析见表4。

表3 Box-Behnken试验设计及结果表

表4 回归模型方差分析表

以单因素实验为基础，分析果汁配比、乳酸菌接种量、发酵温度和发酵时间各因素对苹果红枣复合果汁的感官评价的交互作用，其中试验7、9、11、18、28为中心试验，通过拟合得到了感官评价Y的二次多元回归方程：Y=83.30-0.73A+0.88B-0.98C+0.88D-1.25AC- 3.05AD-2.30BC-1.56BD-1.75CD-4.55A2-5.74B2-5.75C2-3.59D2。通过分析响应面方差，模型P值＜0.000 1，差异极显著；一次项AD，BC的P值＜0.05，差异显著；二次项A2、B2、C2、D2的P值＜0.01，差异极显著，失拟项差异不显著，具有实际意义。由P值可知，影响感官评价得分的单因素：发酵温度＞接种量=发酵时间＞果汁配比。

2.2.3 响应面各因素交互作用分析

三维响应面是回归方程的直观描述，可以形象地体现出各个因素间的交互作用。从图5～图10三维响应面图中可以看出，在所选范围内，均有极值存在，而该极值则是该范围内的最大值点，即感官评分最大值。

由图5可知，感官评分随着乳酸菌接种量的增加先上升后下降，随比例的增加变化缓慢，曲面较平缓，二者交互作用不明显。由图6可知，感官评分随着温度的增加而先增加后减低，随比例的变化缓慢增加，三维图曲面较平缓，二者交互作用不明显。由图7和图8可知，感官评分随各因素的交互作用上升，三维图曲面陡峭，表明各因素之间交互作用显著。由图9可知，感官评分随着接种量的增加而先上升后下降，随时间的增加缓慢增加，曲面较平缓，两者交互作用不明显。由图10可知，感官评分随着温度的增加先上升后下降，随着时间增加缓慢，二者交互作用不明显。

图5 乳酸菌接种量和果汁配比的交互作用图

图6 发酵温度与果汁配比的交互作用图

图7 发酵时间与果汁配比的交互作用图

图8 发酵温度与乳酸菌接种量的交互作用图

图9 发酵时间与乳酸菌接种量的交互作用图

图10 发酵时间与发酵温度的交互作用图

由Design Expert V8.0.6软件，得到优化工艺参数：苹果汁∶红枣汁为7∶3，乳酸菌接种量6.17%，发酵温度29.65 ℃，发酵时间10.38 h。

2.3 验证实验

通过回归模型的预测，得到苹果红枣复合发酵果汁的最佳工艺参数为苹果汁：红枣汁为7∶3、乳酸菌接种量6%、发酵温度30 ℃、发酵时间10.4 h，此时复合发酵果汁的感官评分预测值为83.55。为验证发酵优化工艺的可行性，进行3次平行发酵实验，得到的乳酸菌发酵苹果红枣复合果汁的感官评分为82.16，与理论值83.55，相对误差1.6%，具有可行性，验证了该模型的正确性。

3 质量指标

3.1 感官指标

按照最佳工艺条件优化制得的苹果红枣复合乳酸菌发酵饮料呈棕黄色，既有苹果的清甜口感，又有红枣馥郁的香味，兼具乳酸菌发酵后特殊的乳香，口感酸甜柔和、爽口。饮料稳定，无沉淀浑浊。

3.2 理化指标

pH为4.13；酸度为1.88 mol·L-1。

3.3 微生物指标

菌落总数检测：乳酸菌活菌数为2.6×107CFU·mL-1。 大肠菌群检测：大肠菌群＜3.0 CFU·mL-1。霉菌检测：霉菌＜1×100 CFU·mL-1。

4 结论

通过单因素实验和响应面法优化乳酸菌发酵苹果红枣复合饮料的工艺配方，确定了最佳工艺条件：苹果汁与红枣汁体积比为7∶3，乳酸菌接种量6%，发酵温度30 ℃，发酵时间10.4 h，此条件下得到的饮料感官评价值最高，组织状态稳定，酸甜适宜，兼具苹果红枣香气，具有独特乳酸发酵风味。该研究探究了在实验室条件下苹果红枣复合发酵果汁的最佳工艺，以期为复合发酵果汁提供一种新型发酵类型和参考依据。