骨康宁洗剂皮肤刺激性和过敏性实验研究*

张晓萌，王康俊，陈国彪，王巨才

（海南省药品检验所·海南省药物质量研究重点实验室，海南 海口 570216）

膝骨关节炎（KOA）为严重影响中老年患者生活质量的慢性退行性疾病，属中医“痹证”范畴，中医药在临床治疗KOA 中发挥了重要作用。骨康宁洗剂主要由红花、防风、当归、羌活、血竭组方，主要功效为活血止痛、通络除湿，可用于治疗膝骨关节功能障碍、风寒湿痹引起的关节炎等。为保证骨康宁洗剂临床用药的安全、有效、可控，根据国家药品监督管理局《证候类中药新药临床研究技术指导原则》及原国家食品药品监督管理局药品评审中心《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的指导原则》《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应）研究的技术指导原则》等文件，通过动物实验，对骨康宁洗剂的皮肤刺激性和过敏性进行了系统研究，为其临床应用提供参考[1]。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：CP225D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；UW8200S 型电子天平（日本Shimadzu 公司）；RTZ－10A－RT 型婴儿秤（无锡市衡器厂有限公司）。

试药：骨康宁洗剂（驻马店骨科医院自制，批号为20191101）；2，4－二硝基氯代苯（上海试剂一厂，批号为89－09－01）；丙 酮（洛 阳 市 化 学 试 剂 厂，批 号 为130304）；水为娃哈哈纯净水。

动物：健康成年日本大耳家兔8 只，普通级，体质量2.0 ～3.0 kg，雌雄各半，购自华兰生物疫苗有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（豫）2020－0003，合格证号为NO.1109662011000098。健康Hartely 白色豚鼠，普通级，体质量250 ～350 g，雌雄不拘（雌性无孕或未曾产仔），购自陕西省实验动物质量监督检测中心，实验动物生产许可证号为SCXK（豫）2017－001，合格证号为NO.61003200000425。动物实验室符合国家相关规定，实验期间家兔单笼饲养，豚鼠雌雄分笼饲养、每笼5 只，环境温度（23±2）℃，相对湿度50% ～65%，光照明暗交替各12 h，动物自由饮水、摄食，通风良好，适应性喂养3 d 后进行实验。本实验经我所实验动物伦理委员会审核通过，符合《实验动物福利伦理审查指南》要求。

1.2 实验方法

1.2.1 皮肤刺激性实验

分组：取家兔8 只，随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组4 只，雌雄各半。实验前24 h，用理发器对家兔背部（脊柱两侧）进行剃毛，再用6%硫化钠溶液进行脱毛，去毛范围左、右各10 cm×10 cm。破损皮肤组在用药部位用无菌8 号针头划“井”字，以渗血为度制备破损皮肤。给药前检查去毛皮肤的完整性，有损伤者不得纳入完整皮肤组。

给药：采用同体左右侧自身对比法，取纱布7.5 cm×7.5 cm，4 层，浸骨康宁洗剂原液（20 mL，参照人体用法用量），贴于左侧已去毛的皮肤上，用塑料薄膜覆盖，再用无刺激性胶布和绷带固定；右侧皮肤同法贴敷纯净水（20 mL）浸润纱布，作为空白对照。贴敷6 h 后，除去受试物后用温水清洁给药部位，破损皮肤采用无菌操作。每天给药1 次，连续7 d。

观察指标：单次给药时于首次贴敷去除药物后1，24，48，72 h，多次给药时于每次去除药物后1 h，肉眼观察并记录贴敷部位是否有红斑、水肿、色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等情况，以及发生时间和消退时间。如存在持久性损伤，则延长观察期限，以评价上述变化的恢复情况和时间（不超过14 d）。对于出现中度及中度以上皮肤刺激性的家兔，在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。

评分标准：无红斑、轻度红斑、中度红斑、重度红斑和水肿性红斑分别计0，1，2，3，4 分；无水肿、轻度水肿、中度水肿、重度水肿、严重水肿分别计0，1，2，3，4 分（过敏反应中后2 种水肿均计3 分）。刺激分值＝（红斑积分＋水肿积分）／动物只数。刺激分值＜0.50 为无刺激性，0.50 ～2.99 为轻度刺激性，3.00 ～5.99 为中度刺激性，6.00 ～8.00 为强度刺激性。

1.2.2 皮肤过敏性实验

分组：取豚鼠40 只，随机分为药物组（20 只）、空白对照组（10 只）和模型组（10 只）。致敏前24 h，用理发器对豚鼠脊柱左侧进行剃毛，再用6%硫化钠溶液脱毛，去毛范围10 cm×6 cm，激发前24 h 同法对脊柱右侧进行脱毛处理。

给药：致敏，各组分别于第0，7，14 天对左侧去毛皮肤给予骨康宁洗剂（20 mL）、纯净水（20 mL）和1% 2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液（0.2 mL），将骨康宁洗剂和纯净水分别浸入4 层7.5 cm×7.5 cm 的纱布后贴于左侧去毛皮肤上，2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液均匀涂于左侧去毛皮肤上，均用塑料薄膜覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定，贴敷6 h 后除去受试物，用温水清洁给药部位。激发，首次致敏后第28 天，各组豚鼠右侧去毛区贴敷受试物，操作同致敏给药。

观察指标：激发给药后24，48 h 观察豚鼠皮肤红斑、水肿等过敏反应症状并评分，同时密切观察豚鼠是否有哮喘、站立不稳、休克等严重的全身性过敏反应出现。如结果难以判定，1 周后再次激发。

评分标准：基本同皮肤刺激性实验，但最高分1 分。皮肤过敏反应积分≥1 分的均判为皮肤过敏反应阳性，强度分为弱敏性、轻度致敏、中度致敏、强致敏、极强致敏，对应的过敏反应发生率分别为0 ～8%，9% ～28%，29% ～64%，65% ～80%，81% ～100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 皮肤刺激性实验

单次给药后，破损皮肤组和完整皮肤组家兔的受试皮肤未见明显异常。多次给药后，破损皮肤组2 只家兔受试皮肤出现不规律的轻度红斑，24 h 后红斑消失，均未见色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄、水肿现象发生。完整皮肤组家兔的皮肤未见明显异常。详见表1。

表1 家兔皮肤刺激性实验结果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

表1 家兔皮肤刺激性实验结果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

时间点完整皮肤组 破损皮肤组骨康宁洗剂纯净水骨康宁洗剂纯净水单次给药后 1 h 24 h 48 h 72 h多次给药后 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 0 0 00 0 00 0 00 0 0 0 00 0 00 0 00 0 000000 0.25±0.5 00 0.25±0.5 0 0 000 000 000 0

外用药对破损皮肤有轻微的刺激性是普遍现象。本实验中，破损皮肤组的家兔受试皮肤出现的轻度红斑无规律性，持续时间短，与自身空白对照比较无明显差异（P ＞0.05），考虑为建模、活动剐蹭时的刺激引起，非药物引起的刺激反应。

2.2 皮肤过敏性实验

激发给药24 h 和48 h 后，模型组豚鼠皮肤出现重度红斑、中度水肿，致敏率100%，药物组和空白对照组豚鼠皮肤未见过敏现象，未出现哮喘、站立不稳、休克等严重的全身性过敏反应（P ＜0.05），可判断骨康宁洗剂无致敏性。详见表2。

表2 豚鼠激发实验结果Tab.2 Results of the stimulation test in guinea pigs

3 讨论

KOA 主要临床表现为膝关节疼痛、肿胀、僵硬、功能障碍，严重时导致关节畸形甚至丧失功能，影响患者的正常生活和工作[2]。《膝骨关节炎中医诊疗指南（2020 年版）》指出，中草药／成药外用适用于KOA 的发作期、缓解期、康复期。对治疗KOA 的中成药组方规律进行分析[3]，涉及的289 味中药用药频次排序，当归（75 次）第1，红花（53 次）第3，羌活（47 次）第6，防风（45 次）第8；常用药材组合中，当归－羌活出现频率排第3。

骨康宁洗剂组方中，红花所含红花黄素属查耳酮类化合物，可通过抗氧化、抑制一氧化氮产生、调节免疫应答等机制发挥抗炎作用[4]。金晓东等[5－6]的研究结果显示，红花能降低兔关节液中前列腺素E2和白细胞介素8的含量，通过抑制上述致炎因子起到抑制关节炎症的作用。防风含有色原酮、多糖、挥发油、香豆素等化学成分，具有解热、抗炎、镇痛等药理活性[7－8]。当归所含挥发油藁本内酯具有良好的镇痛作用，有机酸阿魏酸可抑制血小板聚集、改善血液循环，当归多糖的活血功效显著[9]。羌活主要含羌胡醇、异欧前胡素、阿魏酸苯乙醇酯、挥发油等，具有抗炎、镇痛的药理作用，与当归配伍可祛风止痛，与防风配伍可宣通气血[10]。血竭主要成分为黄酮类、苯丙素类、皂苷类、甾醇类等，具有活血化瘀、消肿止痛功效[11]，被誉为活血化瘀“圣药”。我国现有的血竭是百合科龙血树属植物剑叶龙血树Dracaeua cochiuchiueusis（Lour.）S.C.Chen. 和海南龙血树Dracaena cambodiaua Pierre ex Gagnep. 的树脂提取而成，其基源植物主要分布在我国广西和海南一带，剑叶龙血树所产血竭，又称国产血竭或广西血竭，在1991 年被国家批准为一类新药（药材），海南龙血树所产血竭也被收入海南省地方标准[12]。

骨康宁洗剂用于关节功能障碍、跌打损伤、腰肌劳损及风寒湿痹所致关节炎等症状的治疗，主要通过熏洗、敷贴等方式作用于体表皮肤，故有必要通过建立动物模型进行安全性的初步研究。皮肤刺激性实验中，破损皮肤组的家兔出现过不规律的轻度红斑，持续时间短，与自身空白对照比较无明显差异，考虑为破损皮肤建模、家兔活动剐蹭时的刺激所引起，非药物引起的刺激反应。皮肤过敏性实验中，药物组豚鼠未见局部和全身过敏反应。在所设实验条件下，骨康宁洗剂未引起明显的刺激性和致敏性反应，局部用药安全。