HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1和DNMT1的表达及临床意义

龙 丹，王 凯，郭丹丹，杨 梅，徐 丽，张阳春，张春林

(1.遵义医科大学附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

全球范围内，头颈鳞癌发病率在恶性肿瘤中居第6位[1]，吸烟饮酒是已被证实的致癌因素之一。近年研究证实感染高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)与头颈鳞癌的发生密切相关，且头颈鳞癌中HPV的感染率有逐年上升的趋势[2-3]。因此，开展HPV阳性头颈鳞癌的基础研究，对于头颈鳞癌的防治十分必要。HPV阳性头颈鳞癌是一个独特的肿瘤亚组，与HPV阴性头颈鳞癌相比，具有明显的临床特征，如对放化疗反应敏感，预后较好等[4]。HPV阳性头颈鳞癌的生物学特性与HPV病毒直接或间接相关，众多的癌基因及抑癌基因可能参与其中[5]，但是具体的调控机制并不明确。

生殖器形成抑制基因-1(Suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是新近发现的一个重要的抑癌基因，属于PIKKs家族，主要调控p53在G1期信号传导通路，阻滞细胞周期，在DNA损伤修复中发挥作用，其异常表达与肿瘤的发生密切相关[6]。有研究证实在喉鳞癌组织内SMG-1的表达与肿瘤的发生密切相关，SMG-1是预测喉癌预后的重要生物学指标。抑癌基因启动子的异常甲基化可引起目的基因转录失活，参与调控肿瘤的发生发展[7]。DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)可催化肿瘤的启动子甲基化反应，DNMT1已发现在多种恶性肿瘤中均有异常表达[8]，但在HPV阳性头颈鳞癌中的意义仍未明确。不同于HPV阴性头颈鳞癌，HPV阳性头颈鳞癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV阴性头颈鳞癌[9-11]，HPV感染可能与肿瘤的甲基化相关。我们的前期研究也发现，HPV病毒可通过影响甲基化水平调节HPV阳性头颈鳞癌的生物学特性[12]。本研究通过对比HPV阳性头颈鳞癌及HPV阴性头颈鳞癌中SMG-1和DNMT1的表达差异，探讨HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1和DNMT1的表达及临床意义，筛选头颈鳞癌预后的标记物，并为进一步的机制研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集 2014年6月至2017年12月就诊于我院的头颈鳞癌患者的石蜡组织标本105例。所有石蜡标本均经10%的中性福尔马林液固定，后由专业病理医师以2014年WHO诊断标准进行HE染色切片诊断[13]。纳入标准：原发灶病理确诊为头颈鳞癌；有完整的临床资料及标本；标本质量达到HPV-DNA的PCR检测和免疫组化的检测要求。排除标准：原发灶非头颈部肿瘤；合并其他肿瘤；临床资料缺失。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV阳性头颈鳞癌的检测 首先提取石蜡组织标本切片5～10片，厚5 μm，面积100～250 mm2，将处理好的样品装于1.5 mL无菌离心管中，使用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit试剂盒提取样本DNA，使用微量核酸测定仪进行DNA浓度测定和DNA质量评估，使用AmpliTaq GoldTMDNA Polymerase Kit试剂盒，PCR扩增管家基因β-globin进行DNA质控检验，检验合格者则进行HPV-DNA的检测，使用GP5+/GP6+引物巢式PCR扩增HPV-DNA(见表1)，再取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下对条带拍照分析结果。所有石蜡组织标本进行免疫组化法p16蛋白检测。HPV-DNA和p16均阳性的头颈鳞癌标本确定为HPV阳性头颈鳞癌[14]。

表1 PCR扩增β-globin 和 HPV-DNA所用的引物

1.2.2 SMG-1，DNMT1蛋白检测 按照免疫组化Envision法将石蜡组织标本烤片30 min，二甲苯10 min(2次)，按照酒精浓度梯度(100%，95%，80%，70%)进行脱蜡水化，3%双氧水室温封闭8 min，纯水冲洗干净，采用0.01 mol/L柠檬酸高温高压法抗原修复2～3 min，冷却至室温，一抗(兔抗-p16，1∶400稀释，Proteintech公司；兔抗-SMG-1，1∶1 000稀释，Abcam公司；兔抗-DNMT1，1∶2 000稀释，Abcam公司)4 ℃过夜孵育14～18 h，二抗(通用型羊抗兔鼠，福州迈新生物公司)室温孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，干燥，封片，显微镜下观察。

1.2.3 SMG-1，DNMT1蛋白表达结果判定 显微镜400倍光镜下随机选取5个视野，每个视野至少含100个肿瘤细胞，计算阳性率：即5个视野中阳性肿瘤细胞数的均值。SMG-1蛋白表达主要在细胞核及细胞质，DNMT1蛋白表达主要在细胞核，以细胞核/细胞质染成黄棕色或黄褐色为阳性细胞。DNMT1[15]和SMG-1[16]的表达均以半定量法将蛋白表达分为4个水平。DNMT1：阴性(-)，无染色或染色细胞低于5%，计0分；弱阳性(+)，染色细胞为6%～25%，计1分；中强阳性(++)，染色细胞为26%～75%，计2分；强阳性(+++)，染色细胞大于75%，计3分。SMG-1：阴性(-)，细胞核/细胞质无染色，计0分；弱阳性(+)，细胞核/细胞质淡黄色，染色细胞小于50%，计1分；中强性(++)，细胞核/细胞质呈黄色/棕黄色，染色细胞小于40%，计2分；强阳性(+++)，细胞核/细胞质呈褐色/棕褐色，染色细胞大于40%，计3分。

1.3 统计学分析 本实验采用SPSS 23.0软件进行数据分析，两组间二分类资料比较使用χ2检验，有序多分类资料比较使用R×C列联表χ2检验，对T<5超过1/5的分类资料比较使用Fisher精确概率法。两组有序多分类资料的相关性分析使用Spearman秩相关系数。使用Kaplan-Meier法进行生存分析，取α= 0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 头颈鳞癌中HPV的感染率 在头颈鳞癌中HPV的总感染率为21.9%(23/105)，下咽癌中HPV的感染率为27.3%(3/11)，喉癌中HPV的感染率为21.0%(17/81)，口咽癌中HPV的感染率为33.3%(2/6)(见表2)。

表2 HPV在头颈鳞癌中的感染情况

2.2 头颈鳞癌中SMG-1和DNMT1的表达 与HPV感染的相关性头颈鳞癌中SMG-1和DNMT1中的总阳性率为(40.00%，67.62%)， HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1阳性率(21.74%)低于HPV阴性组(45.12%)，DNMT1阳性率(86.96%)高于HPV阴性组(62.20%)，差异均具有统计学意义(P<0.05，见图1，表3)。

A: SMG-1,阴性；B: SMG-1,弱阳性; C: SMG-1,中强阳性；D:SMG-1,强阳性；E：DNMT1,阴性；F: DNMT1,弱阳性；G: DNMT1，中强阳性；H: DNMT1,强阳性。图1 SMG-1,DNMT1在头颈鳞癌中的表达(×400)

表3 SMG-1和DNMT1在头颈鳞癌中的表达

2.3 SMG-1、DNMT1与头颈鳞癌临床特征的关系 所有纳入的头颈鳞癌患者均无远处转移，经R×2列联表χ2检验，SMG-1和DNMT1在N分期和肿瘤分期的差异性表达均有统计学意义(P<0.05)，在性别，年龄，T分期和治疗方式上表达差异均无统计学意义(P>0.05，见表4)。SMG-1与DNMT1表达呈负相关(rs=-0.486，P<0.001，见表5)。

表4 纳入的头颈鳞癌患者临床特征与SMG-1、DNMT1表达情况

表5 SMG-1与DNMT1表达的相关性

2.4 头颈鳞癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表达水平与患者预后的关系 Kaplan-Meier法进行生存分析的结果显示，HPV阳性头颈鳞癌的5年生存率(87.0%)明显优于HPV阴性组的5年生存率(54.9%)，差异有统计学意义(P=0.028)。头颈鳞癌中SMG-1阴性组5年生存率(77.8%)明显优于SMG-1阳性组的5年生存率(38.1%)，差异有统计学意义(P=0.002)，且SMG-1阴/弱阳性组的5年生存率(73.2%)优于SMG-1中强阳/强阳性组的5年生存率(38.2%)，差异有统计学意义(P=0.013)。头颈鳞癌中DNMT1阳性组5年生存率(71.8%)优于阴性组5年生存率(41.2%)，差异有统计学意义(P=0.030)，且DNMT1强阳性组5年生存率(82.5%)明显优于阴/弱阳/中强阳性组5年生存率(49.2%)，差异有统计学意义(P=0.007，见图2)。

图2 头颈鳞癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表达与生存率关系

3 讨论

头颈鳞癌是常见的恶性肿瘤之一，占所有癌症的3%～5%[1]，感染高危型HPV是其主要危险因素之一[2]。HPV病毒通过感染人类黏膜上皮细胞，其癌蛋白E6和E7可分别导致p53和视网膜母细胞瘤(Rb)肿瘤抑制蛋白失活，从而激发HPV相关肿瘤的发生发展[17]。近年来，头颈鳞癌中HPV感染率有升高的趋势，进行头颈鳞癌中HPV感染的检测也越来越被重视。目前，头颈鳞癌中HPV的检测方法尚未统一，不同的研究目的采用不同检测方法，其中包括定量逆转录PCR，免疫组化，原位杂交，免疫印迹等，可分别用于检测HPV的DNA，RNA及相关蛋白，联合多种检测方法可提高检测效率。不同于宫颈癌，HPV相关头颈鳞癌中HPV DNA病毒载量及mRNA转录表达量均较低，往往需要辅以组织标本才能完成HPV检测。本研究使用PCR检测HPV-DNA联合p16免疫组化法检测头颈鳞癌患者的HPV感染情况，与HPV金标准E6/E7 mRNA的分析结果有一致性[14]，在头颈鳞癌中测得HPV的总感染率为21.9%(23/105)，在口咽癌中HPV的感染率为33.3%(2/6)，在下咽癌中HPV的感染率为27.3%(3/11)，在喉癌中HPV的感染率为21.0%(17/81)，与Ni[14]和Gama[18]研究结果类似，其中口咽癌中HPV的感染率略低于我们前期研究[3]的结果，可能原因为本研究组使用PCR检测HPV-DNA联合免疫组化检测p16的方法，剔除了单纯检测HPV-DNA阳性而p16阴性的假阳性标本及HPV一过性感染的样本，增加了检查特异性。HPV阳性头颈鳞癌相较于HPV阴性头颈鳞癌具有对放化疗反应敏感，预后较好等的独特的临床特征[4]。我们的前期研究发现[19]，HPV阳性头颈细胞株(UPCI-SCC-090，UM-SCC-47)相较于HPV阴性头颈细胞株(FaDu，UM-SCC-4)对放化疗更敏感。本研究组HPV的生存分析显示HPV阳性头颈鳞癌的5年生存率(87.0%)明显优于HPV阴性组(54.9%)。因此，对HPV阳性头颈鳞癌的生物学机制研究是十分必要的。介于HPV的存在是头颈鳞癌患者最重要的预后因素之一，众多的癌基因及抑癌基因可能参与其中[5]，本研究组对SMG-1和DNMT1在HPV阳性头颈鳞癌中的表达进行研究。

SMG-1是人体中重要的抑癌基因之一，属于PIKKs家族的成员，参与生物学中多种机制调控，包括参与缺氧反应，参与肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡，修复DNA损伤反应等，其异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关[6,16]。Zhang等[20]报道在胃癌中miR-192和miR-215可下调SMG-1的表达而提高癌细胞的增殖和侵袭特性。周学军等[21]报道在喉鳞癌中SMG-1发挥抑癌基因作用且SMG-1表达缺失的喉鳞癌患者预后良好。HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1的报道较少，HPV病毒的癌蛋白E6可导致p53突变，造成DNA损伤及基因组不稳定[17]，而p53受到其上游基因SMG-1的调控，提示SMG-1可能参与HPV相关头颈鳞癌的发生发展。本研究中HPV阳性头颈鳞癌SMG-1阳性率(21.74%)低于HPV阴性组(45.12%)，提示在HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1表达下调。本研究纳入的头颈鳞癌患者中SMG-1表达随着肿瘤N分期及肿瘤分期的等级提高呈下降趋势，与周学军[21]和Gubanova等[16]中头颈鳞癌的研究结果相似，提示在HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1表达可能与淋巴结浸润及肿瘤分期相关。SMG-1的生存分析显示，头颈鳞癌中SMG-1阴性组5年生存率(77.8%)明显优于SMG-1阳性组(38.1%)，差异有统计学意义(P=0.002)，与Gubanova[16]和Zhang等[19]的头颈鳞癌结果相似，提示HPV阳性头颈鳞癌中SMG-1高表达者预后不良，SMG-1可能成为头颈鳞癌患者预后的标记物之一。

DNMT1是一种将甲基转移至基因组DNA胞嘧啶核苷酸的酶，DNA的甲基化在表观遗传基因调控中起重要作用，异常的甲基化与多种恶性肿瘤的发生发展有关[8]。有研究证实HPV阳性头颈鳞癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV阴性头颈鳞癌[9-11]，HPV感染可能与肿瘤的甲基化相关。本研究中HPV阳性头颈鳞癌DNMT1阳性率(86.96%)高于HPV阴性组(62.20%)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示在HPV阳性头颈鳞癌中DNMT1表达上调。相关研究报道在HPV阳性头颈鳞癌中存在RXRG[9]，EREG[10]，p16[11]等多种抑癌基因的异常甲基化及其沉默，与DNMTs密切相关。本研究组中SMG-1和DNMT1表达呈负相关，提示SMG-1和DNMT1可能参与HPV阳性头颈鳞癌中抑癌基因的异常甲基化，调控肿瘤的发生发展。头颈鳞癌中DNMT1表达随着N分期及肿瘤分期等级提高呈上升趋势，提示HPV阳性头颈鳞癌中DNMT1表达可能与淋巴结浸润及肿瘤分期相关。DNMT1的生存分析显示，头颈鳞癌中DNMT1阳性组5年生存率(71.8%)明显优于DNMT1阴性组(41.2%)，与Xue等[22]的头颈鳞癌结果相似，提示HPV阳性头颈鳞癌中DNMT1低表达者预后不良，DNMT1可能成为头颈鳞癌患者预后的标记物之一。

在HPV阳性头颈鳞癌中，SMG-1与DNMT1表达呈负相关，SMG-1和DNMT1均与头颈鳞癌的预后相关，SMG-1高表达者预后不良，DNMT1低表达者预后不良，我们前期研究显示[19]HPV阳性头颈细胞株对放化疗敏感性强于HPV阴性细胞株。因此，本研究为进一步的研究提供参考，在HPV阳性头颈鳞癌中，DNMT1可能通过调控SMG-1的表达，提高肿瘤对放化疗敏感性，从而影响其预后，为后续研究探讨DNMT1和SMG-1在HPV阳性头颈鳞癌中的作用机制提供依据。