Villin1启动子调控miR-7-Sponge真核表达载体的构建及其对小鼠炎症性肠炎模型的影响

王 亚，赵娟娟，曾文焕，刘依婷，梁 杰，贺 钰，蒲廷莉，陈世鹏，李冬玫，徐 林

(1.贵州省基因检测与治疗特色重点实验室暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义 563099；2.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学 免疫学教研室，贵州 遵义 563099)

随着生活节奏的加快，饮食结构的改变，炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的发病率不断攀升，且易复发，严重影响人类的健康。炎症性肠病包括克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)等，是一种病因(包括遗传学、环境、微生物菌群及免疫失衡等)尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其主要特征是黏膜下大量炎症细胞的浸润和肠上皮层的损伤[1-2]。因此，深入探讨 IBD 内源性的发生调节机制有助于为该疾病的预防、诊断和治疗提供新的策略。

MicroRNA(miRNAs)是进化保守的长度为18～24个核苷酸的单链非编码小分子RNA，可在转录后调控基因的表达水平[3]。近年来，已发现许多miRNAs参与IBD的发生和发展进程。如IBD患者肠道炎症粘膜中miR-301a升高通过下调SNIP1诱导IL-17和TNF-α的表达促进肠道粘膜炎症[4]。 CD或UC患者结肠组织中miR-31的增加，通过降低炎症细胞因子受体(Il7R和Il17RA)和信号蛋白(GP130)的表达，而减轻小鼠结肠上皮的炎症反应，同时通过调节WNT和Hippo信号通路，促进损伤后肠上皮细胞的再生[5]。另外也有研究显示，过表达miR-129可抑制泛素E3连接酶FBW7介导的IκBα降解和NF-κB活化改善了TNBS诱导的肠道炎症和结肠炎[6]。这些研究有力提示 miRNAs是IBD新的重要调节子。

MicroRNA-7(miR-7)作为miRNAs家族成员，不仅在多个物种中具有高度保守性，且在机体的多种重要生命过程及疾病进程中扮演重要角色，可作为多种疾病诊断治疗的靶标[7-8]。越来越多的研究表明miR-7在IBD等多种肠组织相关疾病的发生中具有重要调控作用。如Zhang等[9]发现通过改变HCT116、LOVO等多种肠系肿瘤细胞系中miR-7的水平，其可通过作用靶分子YY1抑制肿瘤的发生；Zeng等[10]的研究也显示上调结肠癌HCT-8和Caco-2细胞中miR-7水平可抑制肿瘤的增殖和侵袭；重要的是，Fasseu等[11]发现UC或CD患者发炎的结肠组织中miR-7的水平明显上调，另外也有研究显示miR-7在活跃期CD患者结肠组织中明显低表达[12]。新近，Guo等[13]研究发现抑制miR-7表达可改善 TNBS诱导IBD模型小鼠的损伤。有意思的是，Nguyen等[12]的研究提示改变肠上皮细胞中miR-7水平后，通过改变miR-7的靶分子CD98的表达而影响肠上皮细胞外基质的粘附、增殖和分化，与IBD的发生密切相关。由此提示肠上皮细胞中miR-7的水平与IBD的发生进程密切相关。因此我们拟通过构建小鼠IBD模型，观察发现miR-7的表达及定位，并靶向改变小鼠结肠组织靶细胞中miR-7的表达水平，探讨其对IBD病理损伤的影响。

绒毛蛋白1(Villin1)是一种细胞骨架蛋白，主要分布在肠绒毛刷状缘上皮细胞中，已被证明是一种肠道上皮细胞特异性肌动蛋白结合蛋白[14]。其在肠上皮细胞中明显高表达，已有研究将Villin1启动子作为肠上皮细胞中基因表达调控的重要元件[15]。因此，我们利用Villin1作为启动子构建调控miR-7海绵体序列(Sponge)表达的真核表达载体，miR-7-Sponge即课题组前期利用miRNAs Sponge(海绵体)技术合成[16]，通过靶向干预小鼠结肠上皮细胞中miR-7的表达，初步探讨下调肠上皮细胞中miR-7的水平对DSS诱导的小鼠IBD模型进程的可能影响，以期为后续研究治疗炎症性肠病提供前期工作基础。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂及仪器 SPF级C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠，7～8周龄，购于南京大学模式动物研究所，饲养于遵义医科大学SPF级动物实验室。质粒pGL3-Basic、大肠杆菌DH5α感受态细胞为本实验室保存；miR-7 Sponge双链寡核苷酸、引物合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成；限制性内切酶KpnI、MluI、XhoI及T4DNA连接酶(Thermo Scientific公司)；基因组DNA提取试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)；质粒抽提试剂盒(QIAGEN有限公司)；TRIZOL裂解液、SYBR Premix Ex Taq real - time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；地高辛标记miRNA-7探针(丹麦Exqion公司)；浓缩型正常山羊血清封闭液(博士德生物工程有限公司)； EPCAM(华安生物技术有限公司)、羊抗兔FITC(Abcam)、山羊抗兔抗地高辛DyLight®594(VECTOR公司)；分析纯级异丙醇、二甲苯、无水乙醇、甲醛、苏木素/伊红染色液(重庆川东化工)；S1000TM Thermal cycler PCR仪、C1000TM Thermal cycler real-time PCR仪(Bio-Rad公司)；IX-53倒置显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 荧光原位杂交技术 取小鼠结肠组织，4%多聚甲醛溶液固定48 h，然后包埋、切片；烘箱60 ℃，2 h烤片，二甲苯20 min脱蜡处理，梯度乙醇(100%，95%，80%，70%)5 min/每个浓度。去离子水洗涤5 min×3次。1×柠檬酸盐缓冲液中加压蒸煮10 min进行抗原修复，后室温冷却。用纯DEPC水冲洗玻片，再放入DEPC洗缸中洗涤5 min×3次。100 μL预热的杂交液(变性地高辛标记的DNA探针缓冲液)滴加于玻片上，37 ℃孵育箱中30 min，再在每张玻片上滴加混合液(杂交探针液和变性地高辛标记的DNA探针缓冲液1∶1均匀混合)，37 ℃过夜。过夜后，洗涤、封闭液封闭，加一抗兔来源EPCAM(1∶500)，37 ℃，2 h。1×PBS洗涤5 min×3次，加二抗山羊抗兔FITC(1∶500)和山羊抗兔抗地高辛DyLight®594(1∶500)，室温避光孵育2 h。DAPI(1∶1 000)，滴加于玻片上10 min，洗涤，进行封片，后荧光显微镜扫描分析。

1.2.2 PCR扩增Villin1启动子序列 根据NCBI数据库获得Villin1启动子序列，设计引物序列：上游5′- TGATGACCTGTCAGCTTCCC -3′，下游5′- GATAAAGCGCCGTTCCACAC -3′。抽提小鼠结肠组织基因组DNA为模板，PCR扩增Villin1启动子序列(1799 bp)，PCR条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 5 min。

1.2.3 pGL3-Basic-Villin1载体的构建及鉴定 将Villin1启动子的PCR产物克隆入pGL3-Basic载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒。使用限制性内切酶KpnI酶和MluI酶做双酶切鉴定后测序鉴定重组质粒pGL3-Basic-Villin1(p-V)。

1.2.4 p-V-miR-7sp载体的构建及鉴定 MiR-7sp双链寡核苷酸由我们课题组前期设计合成[16]。用MluI/XhoI酶分别双酶切pGL3-Basic-Villin1、目的基因miR-7sp，产物过夜连接。连接反应体系：10×T4Ligase buffer 2μL，目的基因(MluI+XhoI)1μg，pGL3-Basic-Villin1(MluI+XhoI)1μg，T4DNA Ligase1μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：16℃过夜。转化连接产物到DH5α感受态细胞，随机挑取克隆摇菌，提取质粒。用限制性内切酶MluI酶和XhoI酶做双酶切鉴定，以及用限制性内切酶KpnI酶、MluI酶和XhoI酶做三酶切鉴定，酶切、测序鉴定后大量抽提，重组质粒命名为pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(p-V-miR-7sp)。

1.2.5 DSS模型建立与分组 (1)选择7～8周龄的C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠随机分为两组：①p-Cont组(DSS+p-V，n=5)；②p-V-miR-7sp组(DSS+p-V-miR-7sp，n=5)。(2)将DSS溶于饮用水中，配置成浓度为2%的葡聚糖硫酸钠溶液，供两组小鼠自由饮用7 d，3 d水恢复。(3)建模后第2天，根据小鼠体重分别按照5 mg/kg量经尾部静脉注射p-V和p-V-miR-7sp，每天对两组小鼠进行称重，第10天，断颈法处死小鼠，观察两组小鼠结肠形态和长度，后用于下一步实验。

1.2.6 Real-time PCR检测细胞miR-7的表达 分别收集两组小鼠心、肝、肾、结肠、淋巴结组织样本，TRIZOL法提取各样本RNA。MiR-7、内参基因U6逆转录反应体系及条件分别按试剂盒说明书操作，Real-time PCR反应体系按照2×SYBR®Premix Ex TaqTM10 μL，PCR Primer 1 μL，ddH2O 7 μL,cDNA 2 μL的比例分别配足20 μL的体系，反应条件为95 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 30 min，40个循环。

1.2.7 H&E染色 取目的器官，4%多聚甲醛固定48 h后，石蜡包埋，切片，进行H&E染色，然后显微镜下观察其病理结构的变化。

2 结果

2.1 MiR-7在IBD小鼠结肠上皮细胞中高表达 荧光原位杂交实验结果显示，miR-7在DSS诱导的IBD模型小鼠结肠组织中明显高表达且主要定位于结肠上皮细胞(EPCAM+细胞)中(见图 1)。

2.2 pGL3-Basic-Villin1载体的构建及鉴定 以WT小鼠结肠组织基因组DNA为模板，PCR扩增Villin1序列，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在1 799 bp的位置出现目的条带(见图 2A)。PCR产物经KpnI酶和MulI酶双酶切纯化后，亚克隆入pGL3-Basic载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后进一步提取质粒。利用KpnI酶和MulI酶做双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳后出现了4 818 bp和1 799 bp左右的两条带(见图 2B)，并通过质粒测序结果(见图 2C)，证明pGL3-Basic-Villin1(p-V)载体成功构建。

A：PCR扩增Villin1启动子序列；B：p -V重组质粒Kpn I/Mul I双酶切鉴定；C：p -V重组质粒测序鉴定。图2 PCR扩增Villin1的凝胶电泳图以及p-V重组载体的酶切及测序结果

2.3 p-V-miR-7sp载体的构建及鉴定 将目的基因miR-7sp与pGL3-Basic-Villin1的连接产物转化到DH5α感受态细胞，随机挑取克隆摇菌，并提取质粒。利用MluI酶和XhoI酶做双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳后出现了6 617 bp和140 bp左右的两条带(见图 3A-1)。通过KpnI酶、MluI酶和XhoI酶做三酶切后进行琼脂糖凝胶电泳出现了4 818 bp、1 799 bp和140 bp左右的三条带(见图 3A-2)，并通过质粒测序结果(见图 3B)，证明pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(p-V-miR-7sp)载体构建成功。

A:p-V-miR-7sp重组质粒 Mlu I/Xho I 双酶切，Kpn I/Mlu I/Xho I 三酶切鉴定； B:p-V-miR-7sp 重组质粒测序鉴定。图3 p-V-miR-7sp重组质粒酶切及测序结果鉴定

2.4 p-V-miR-7sp载体对多个组织中miR-7表达的影响 DSS诱导IBD小鼠模型，分别经p-Cont和p-V-miR-7sp治疗后，取样观察IBD小鼠心、肝、肾、结肠、淋巴结组织，Real-time PCR 检测了各组织中miR-7的相对表达水平，如图4所示，p-V-miR-7sp治疗后显著降低小鼠结肠组织中miR-7的表达水平(P<0.05)，而在其他组织中无明显差异(P>0.05)。

*：与对照组比较，P<0.05，ns：no significant。图4 不同组织器官中miR-7的相对表达量

2.5 p-V-miR-7sp载体对IBD小鼠结肠组织的影响 DSS诱导IBD小鼠模型，分别经p-Cont和p-V-miR-7sp治疗后，观察IBD小鼠结肠组织的长度变化：较p-V-miR-7sp组，p-Cont组小鼠结肠长度明显缩短，明显充血、水肿(见图 5)。

图5 p-V-miR-7sp载体对小鼠结肠形态和长度的影响

2.6 p-V-miR-7sp载体对IBD小鼠结肠组织病理结构的影响 H&E染色结果显示，p-Cont组小鼠的结肠上皮和隐窝的结构明显破坏，甚至消失，大量炎性细胞浸润，病变达到粘膜和粘膜下层；而p-V-miR-7sp组，结肠上皮几乎完整，隐窝结构被轻微破坏，并且这种作用伴随着大量的杯状细胞增生(见图 6)。

图6 H&E法检测p-V-miR-7sp载体干预后模型小鼠结肠组织的病理结构变化

3 讨论

越来越多的研究证明，miRNAs作为许多生物学过程中的关键分子参与调控生物体的生长发育过程和一系列的生命活动，并可作为潜在预防、诊断、治疗的新靶标[17-18]。miR-7作为miRNAs家族成员，在机体的多种重要生命过程及疾病进程中扮演重要角色。目前大量的研究主要集中在肿瘤生物学方面，如miR-7可通过多种不同靶基因调控肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌等[19-23]的发生进程，这些研究显示 miR-7可作为多种肿瘤诊断、治疗及预后的重要靶标。近年来，多研究表明miR-7在免疫系统的发育、功能及免疫相关疾病的发生中具有重要调控角色。如Wang等[24]研究发现miR-7可介导的PTEN/AKT信号通路促进B细胞向浆细胞分化和自发生发中心形成，促进红斑狼疮的发展；Deng等[25]报道通过下调脓毒症患者血浆中提取的外泌体中miR-7的水平可抑制T淋巴细胞凋亡而降低死亡率；我们的系列研究也显示miR-7可调控多种炎症疾病的发生进程，如自身免疫性肝炎[26]、脑组织炎症[7]、肺组织炎性损伤[27]等，这些研究提示miR-7在炎症相关疾病的发生中具有重要作用。重要的是新近研究发现miR-7在IBD病变组织中高表达且水平改变后可明显影响IBD的发生进程，如：Guo等[28]研究发现IBD患儿组织中miR-7表达增加，且与三叶因子3(TFF3)蛋白表达负相关；Yu等[29]研究表明miR-7抑制物可调控RNF183，下调IκBα的泛素化和降解从而减轻肠道炎症的进程。这些研究显示miR-7在炎症性肠炎的发生进展中具有重要调控角色。

在本研究中，我们首先通过荧光原位杂交技术检测IBD模型小鼠结肠组织中miR-7的水平，发现miR-7在结肠组织中的表达水平明显增高，重要的是且主要定位于结肠上皮细胞中，提示结肠上皮细胞中miR-7的水平改变与IBD的发生密切相关。为了靶向下调结肠上皮细胞中miR-7的水平，我们构建了由结肠上皮细胞中明显高表达的基因Villin1为启动子调控的miR-7 Sponge(sp)真核表达载体，通过尾部静脉注射观察干预结肠上皮细胞中miR-7后对DSS诱导的小鼠IBD病理损伤的影响。首先以WT小鼠结肠上皮组织基因组DNA为模板，利用PCR扩增基因Villin1启动子序列，扩增产物经KpnI酶和MluI酶双酶切后克隆入pGL3-Basic载体，克隆产物经琼脂糖凝胶电泳、酶切和测序结果显示成功构建pGL3-Basic-Villin1载体，然后将化学合成的干扰miR-7表达的miR-7sp序列，经MluI酶和XhoI酶双酶切，克隆入pGL3-Basic-Villin1载体，克隆产物经琼脂糖凝胶电泳、双酶切和三酶切鉴定及测序验证，结果表明成功构建真核表达载体pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(命名为p-V-miR-7sp)。许多证据证明miR-Sponge是体内不同miRNAs分子功能丧失的有效策略[30]。而我们的前期数据表明，miR-7-Sponge可以有效抑制肺、脾、脑、肝脏等在内的小鼠多个器官中的miR-7表达[27]。重要的是，我们将miR-7-Sponge构建到含有结肠上皮细胞特异高表达基因Villin1启动子的真核表达载体上，通过尾部静脉注射到DSS诱导的IBD模型小鼠中，Real-time PCR检测结果显示小鼠结肠组织中miR-7的表达水平显著降低，而在其他组织中无明显差异，表明p-V-miR-7sp真核表达载体可以特异下调小鼠结肠上皮组织中miR-7水平。重要的是，随着IBD小鼠结肠上皮组织中miR-7水平的下调，小鼠结肠组织充血、水肿减轻，伴随较长的结肠长度，隐窝结构轻微破坏，炎症症状显著减轻，这些结果提示基于Villin1启动子调控的miR-7sp真核表达载体不仅可有效靶向下调结肠上皮组织中miR-7的表达水平并且可显著减轻IBD的病理损伤。

然而，IBD发病机理复杂，是由遗传因素，免疫系统和环境(包括肠道微生物群)之间复杂相互作用的结果[1]。目前我们观察到的p-V-miR-7sp真核表达载体可显著改善IBD的病理损伤，然而涉及免疫系统及靶分子的具体调节机制需要进一步深入探讨。另外已有的研究证明miRNAs参与肠道菌群的选择及其稳态的维持[31]，但miR-7是否通过菌群调节进而影响肠道免疫反应仍待进一步明确。此外，虽然目前在临床IBD治疗中所应用的药物(例如硫嘌呤或抗TNF)治疗是有效的，但产生的副作用明显，如用于IBD治疗的大多数药物在免疫抑制期间都可能引起肝脏毒性，以致多达三分之一的患者对这些疗法难以忍受[32]。也有研究显示促炎途径如IL-12/ IL-23轴，IL-6途径或Janus激酶抑制剂的新型疗法以及其它调节抗炎信号通路的方法正在探索中[33]。因此，尽快阐明IBD新的干预策略对于IBD的临床治疗具有重要意义。针对我们的研究，亟待进一步阐明Villin1调控miR-7sp载体干预IBD病理损伤所涉及的抗炎相关信号通路，并完善其安全性及靶向性相关工作。

总之，在本研究中我们不仅成功构建了结肠上皮细胞特异基因Villin1启动子调控的miR-7干扰序列miR-7sp真核表达载体，而且初步发现该载体的干预应用可较好的改善IBD的病理损伤，这为后续开发基于miR-7靶向基因治疗肠组织相关疾病的新策略提供重要的前期实验基础。