七叶皂苷钠对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

汪 雷 胡火军 马金阳 黄 松 董元训 王旭光 周有东

缺血性脑卒中是常见的脑血管疾病，约占脑卒 中的80%[1，2]。当缺血性脑卒中发生后，在一定时间内恢复血液供应，反而造成更严重的脑功能障碍，这种现象称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）。研究表明，抑制缺血性脑卒中炎症反应和氧化应激，可有效改善CIRI[3]。七叶皂苷钠具有抗炎、消除肿胀、改善微循环、清除自由基等作用。研究表明，七叶皂苷钠可以抑制炎症介质的释放，减轻高原脑损伤及脑水肿[4]。本文探讨七叶皂苷钠大鼠CIRI的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组60 只成年雄性SD 大鼠，8 周龄，体重220～250 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。按随机数表法将大鼠分为假手术组、模型组和七叶皂苷钠组，每组20只。

1.2 建立CIRI 大鼠模型 按参考文献[5]报道的方法建立CIRI。腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，在颈部正中切开皮肤并钝性分离各层组织，暴露颈总动脉及分支，尼龙线结扎右颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉。右颈外动脉、右颈内动脉以及大脑左前动脉残端处插入拴线并固定，松开动脉夹。缺血2 h后，取出拴线结扎颈外动脉残端实现再灌注。假手术组大鼠进行上述手术，但不插入拴线。CIRI 大鼠造模成功的标准为：大鼠不能直线行走，向右转圈或向右倾倒，提尾时右前肢弯曲。

1.3 给药方法 按参考文献[6]报道的方法，七叶皂苷钠组建模1 h后一次性腹腔注射七叶皂苷钠（2.8 mg/kg；武汉爱民制药股份有限公司），假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。

1.4 大鼠神经功能评分 造模后24 h，采用Longa 评分评估大鼠神经功能[7]：0 分，大鼠行为完全正常；1分，大鼠右前肢不能完全伸直；2分，大鼠爬行时有向右盘旋的行为；3 分，大鼠爬行时向右倾倒；4 分，大鼠丧失行走能力，意识丧失。

1.5 大鼠脑含水量的测定 造模后24 h，每组取5 只大鼠，脱椎处死取出脑组织，用滤纸吸干表面水分后称其湿重，然后放置在恒温干燥箱烘干，称其干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.6 ELISA 检测损伤脑组织氧化应激和炎症反应指标 造模后24 h，每组取5只大鼠分离损伤脑组织，加入RIPA裂解液均浆，4 ℃离心25 min（2 500转/min），取上清液。按ELISA 试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）说明书操作，检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6及IL-1β的含量。

1.7 TUNEL 染色检测损伤脑组织神经元凋亡率 造模后24 h，每组取5 只大鼠，灌注固定后分离损伤脑组织，石蜡切片，常规脱蜡至水，加入胰蛋白酶K 工作液，37 ℃处理25 min，洗涤3 次，酒精脱水，按照TUNEL 试剂盒（美国Invitrogen 公司）说明书进行操作，用抗荧光淬灭封片后，在荧光显微镜下观察细胞数目。随机选取5个视野，观察并计算细胞凋亡率。

1.8 免疫印迹法检测损伤脑组织凋亡相关蛋白的表达 造模后24 h，每组取5只大鼠分离损伤脑组织，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳，并转至PDVF 膜。5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，PBS洗涤3次，加入一抗NFκB p65 抗体（1:1 000；美国Invitrogen 公司）、双特异性 磷 酸 酶1 抗 体（dual- specific phosphatase 1，DUSP1；1:1 000；美国GeneTex公司）、Bcl-2抗体（1:1 000；美国Invitrogen 公司）和Bax 抗体（1:1 000；美国Invitrogen 公司），4 ℃下孵育过夜。TBST 洗膜3 次，加入二抗（1:5 000；美国Invitrogen 公司），37 ℃下孵育1 h，TBST洗膜3次。用ECL试剂盒进行显影。采用图像分析软件ImageJ 进行灰度值分析，以β-actin作为内参。

1.9 统计学处理 采用SPSS 22.0软件分析；计量资料以±s表示，使用单因素方差分析和LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 七叶皂苷钠对CIRI 大鼠神经功能的影响 与假手术组相比，模型组大鼠Longa 评分显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，七叶皂苷钠组大鼠Longa评分显著降低（P＜0.01）。见图1。

图1 七叶皂苷钠对大鼠CIRI后神经功能的影响

2.2 七叶皂苷钠对CIRI 大鼠脑含水量的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑含水量显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，七叶皂苷钠组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.01）。见图2。

图2 七叶皂苷钠对大鼠CIRI后脑含水量的影响

2.3 七叶皂苷钠对CIRI大鼠氧化应激和炎症反应的影响 与假手术组相比，模型组大鼠损伤脑组织MDA、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平显著增高（P＜0.001），SOD 和CAT 水平显著降低（P＜0.001）。与模型组相比，七叶皂苷钠组大鼠损伤脑组织MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低（P＜0.001），SOD和CAT水平显著增高（P＜0.001）。见图3。

图3 七叶皂苷钠对大鼠CIRI后损伤脑组织炎症反应和氧化应激反应的影响

2.4 七叶皂苷钠对CIRI大鼠损伤脑组织神经元凋亡的影响 与假手术组相比，模型组大鼠损伤脑组织神经元凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，七叶皂苷钠组大鼠损伤脑组织神经元凋亡率显著下降（P＜0.01）。见图4。

图4 七叶皂苷钠对大鼠CIRI后损伤脑组织神经元凋亡的影响

2.5 七叶皂苷钠对CIRI 大鼠损伤脑组织DUSP1、NF-kB p65、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠损伤脑组织DUSP1 和Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），NF-kB p65和Bax蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）。与模型组相比，七叶皂苷钠组大鼠损伤脑组织DUSP1和Bcl-2蛋白表达表达显著增高（P＜0.05），NF-kB p65和Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 七叶皂苷钠对大鼠CIRI后损伤脑组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

缺血性脑卒中是一种具有高发病率、高致残率和高病死率特点的急性脑血管疾病，是血管性疾病导致病人残疾和死亡的主要原因之一[8，9]。目前，治疗缺血性脑卒中最有效的方法就是及时进行溶栓治疗，然而药物溶栓受到严格的时间限制（4.5 h 内），且容易诱发CIRI[10，11]。CIRI是大脑短暂供血不足后又快速恢复供血，从而使氧化应激、炎症反应加重，导致细胞自噬、凋亡增加等一系列的病理过程[12，13]。CIRI 后小胶质细胞激活释放炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等引发炎症反应，导致继发性损伤[14]。此外，在CIRI 过程中，会产生MDA，下调包括SOD、CAT 在内的内源性抗氧化酶的活性，干扰细胞内的离子稳态并诱发炎症反应，从而引起缺血组织的进一步损伤[15，16]。本研究发现，大鼠CIRI后，损伤脑组织MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6 水平显著增高，SOD和CAT 水平显著降低，同时神经元细胞凋亡率显著增加，神经功能损伤和脑水肿显著加重。

七叶皂苷钠是一种七叶树科植物中提取的含酯键的三萜皂苷，临床上用于脑水肿、创伤及手术所致的肿胀，同时也用于静脉回流障碍性疾病[17]。研究表明，七叶皂苷钠通过上调细胞因子信号传导抑制因子1的表达，发挥抗炎作用，减轻大鼠脑出血损伤[18]。另外，七叶皂苷钠可通过调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，降低炎症因子水平，减轻氧化应激损伤，改善小鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障及神经功能障碍[6]。本研究发现七叶皂苷钠能够显著降低CIRI后炎症因子水平，降低MDA 水平，提高SOD 和CAT 水平，促进Bcl-2表达，抑制Bax表达，减少细胞凋亡。

DUSP1 是MAPK 家族成员，可参与T 细胞的活化，对免疫性疾病有保护作用[19]。研究表明，DUSP可使MAPK失活，对心肌损伤起到保护作用[20，21]。此外，DUSP1在在心脏缺血再灌注损伤后显著下调，上调DUSP1可减轻Mff/Binp3活化，并使JNK信号通路失活，保护缺血再灌注应激后的心肌组织[22]。还有研究表明DUSP1能够抑制NF-κB向细胞核内转移，从而抑制NF-κB的活性[23，24]。NF-κB是一种能激活多种基因表达的二聚体转录因子，参与炎症过程。本研究发现七叶皂苷钠能够显著促进DUSP1 的表达，抑制NF-kB p65的表达。

总之，七叶皂苷钠对大鼠CIRI 具有神经保护作用，机制可能是通过促进DUSP1 的表达，抑制NFκB活性，发挥抗炎、抗氧化应激，抑制凋亡的作用。