基于HIF-VEGF-Notch通路探讨通脉活血汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠的保护作用

李慧 李丹丹 吴珠 朱丽朋 李和教 王源江

(海南医学院第一附属医院 1药剂科，海南 海口 570102；2针灸科；3神经内科)

局灶性脑缺血再灌注损伤(FCIRI)是颅脑机械性、溶栓性和手术性创伤引起的主要并发症。相关主要非介入治疗方法往往是针对急性期的血液循环障碍和神经元毒性而采取的溶栓、抗炎抗氧化和减轻脑血肿水肿等措施控制继发性脑损伤〔1〕。神经元受损是导致神经功能障碍的根本原因，而促进神经元和相关营养细胞再生修复才是恢复神经功能的关键所在。向病灶补充内源性或外源性神经干细胞(NSCs)能够帮助神经元和星形胶质细胞等相关营养细胞再生修复。钟波等〔2〕向大鼠脑缺血部位移植NSCs取得较好治疗效果。姜英虹等〔3〕研究表明，许多中药制剂可通过不同的信号通路和途径调节NSCs增殖分化。周胜强等〔4〕研究表明补阳还五汤能促进大鼠NSCs增殖。通脉活血汤与补阳还五汤配方相似，其中丹参有类似作用，且两者兼具补气活血通络的功效〔5〕。因此验证通脉活血汤是否有调控NSCs增殖分化作用，对该药的临床开发有一定指导意义。本研究以雄性SD大鼠为研究对象，线栓法构建大鼠脑中动脉阻塞(MCAO)模型模拟FCIRI，腹膜下注射通脉活血汤和低氧诱导因子(HIF)-1α转录抑制剂(YC-1)干预治疗，通过观察大鼠神经功能状况、组织学鉴定NSCs增殖分化情况和检测HIF-血管内皮生长因子(VEGF)-Notch各节点水平，探讨通脉活血汤对FCIRI大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性清洁级SD大鼠54只，4～5月龄，体重为(230±20)g，购自海南医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(琼)2017-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(琼)2017-0046，动物质量合格证号：20180169，鼠房模拟昼夜交替(12 h/12 h)，温度(23±2)℃，相对湿度范围为(55±15)%。给予充足的食物和清洁的饮水，定期更换垫料保持鼠箱干燥卫生。

1.2药品与试剂 曲拉通X-100(Triton-X-100)、HIF-1α转录抑制剂(YC-1)均购自美国Sigma-Aldrich公司，批号分别为T9284、Y1027；兔抗Sox2多克隆抗体、鸡抗GFAP多克隆抗体、羊抗兔IgG H&L (Allophycocyanin)预吸附二抗、羊抗鸡IgG H&L(Cy3®)预吸附二抗、兔抗HIF-1α单克隆抗体、大鼠VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、兔抗activated Notch1多隆抗体和兔抗β-actin单克隆抗体均购自英国Abcam公司，批号分别为ab97959、ab4674、ab130805、ab97145、ab179483、ab100786、ab8925、ab8227；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，批号BA1054。

1.3主要仪器 JR-30型恒温鼠台购自成都泰盟软件有限公司；CM1950型冰冻切片机购自德国徕卡公司；CKX53型倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；PHOMO型酶标仪购自郑州安图生物工程股份有限公司；大鼠用脑立体定位仪、MCAO用线栓、大鼠脑模具购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；LHZW001蠕动泵购自惠州市联合众为科技有限公司；eBlot®L1电转膜仪购于南京金斯瑞生物科技有限公司；LightCycler®480 Ⅱ PCR仪购自瑞士罗氏公司。

1.4实验方法

1.4.1通脉活血汤配制 采用三九制药生产的免煎饮片来配制通脉活血汤。配方：当归10 g、赤芍8 g、川芎8 g、红花8 g、丹参10 g、元参8 g、地龙10 g、全蝎4 g、鸡血藤10 g、甘草 4 g。以上药物来自海南医学院第一附属医院药房，所有药材经海南医学院第一附属医院李和教副主任药师鉴定。将以上单味药免煎饮片用分析天平称取混合后溶解于1 000 ml 5%葡萄糖溶液中，配制成有效成分80 mg/ml药液。200 ml带有鲁尔接头的无菌注射器连接滤菌器对配制好的药液进行过滤分装，4℃保存，用于腹膜下注射给药。

1.4.2动物分组与给药 将54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、抑制剂组〔2.5 mg/(kg·d)〕、通脉活血汤低剂量组〔20 mg/(kg·d)〕、通脉活血汤中剂量组〔40 mg/(kg·d)〕和通脉活血汤高剂量组〔80 mg/(kg·d)〕，每组各9只。大鼠造模成功后即开始药物干预，每天称重后按照体重给药。抑制剂组腹膜下注射2.5 mg/kg YC-1/二甲基亚砜溶液，1次/d〔6〕，通脉活血汤低、中、高剂量组按照20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg腹膜下注射通脉活血汤药液1次/d。假手术组和模型组注射2.5 ml 5%葡萄糖注射液，1次/d。连续给药1 w后进行后续实验。

1.4.3动物建模 线栓法构建大鼠MCAO模型〔7〕，模拟局灶性脑缺血。尾静脉注射3%戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉大鼠，再将大鼠仰卧置于恒温鼠台上，使肛温保持在(37±1)℃。剪开大鼠颈部皮肤，玻璃分针挑起右侧颈动脉；以颈总动脉分支点为中心，对大鼠右侧总颈动脉和颈外动脉进行近中心点结扎；线栓沿大鼠颈内动脉推进，待有明显阻力时停止推进，此时手术线已经越过脑中动脉分支点，实现MCAO。保持2 h后撤出栓线，在近中心点位置结扎颈内动脉，缝合伤口，完成造模。假手术组只在近中心点位置结扎颈内动脉，不进行MCAO。

1.4.4大鼠神经功能评分 药物干预结束后首先进行神经功能评分测试。评分采用改进自5分法〔8〕：0≤分数<1为正常状态；1≤分数<2为轻度损伤，拽尾拖曳反抗时左前肢伸展无力；2≤分数<3为中度损伤，左侧跛行无法或直行障碍；3≤分数<4为重度损伤，站立不稳易向左侧倾倒；4≤分数<5为严重损伤，不能行走，意识不清醒。

1.4.5样本采集 对大鼠进行神经功能评分后，将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，剪开寰枕处皮肤，灰色头皮针穿入枕大池，微量进样器抽取脑脊液100 μl，注入EP管-20℃冻存用于ELISA检测。采集后回输100 μl生理盐水用于维持颅内压，缝合伤口，用于下一步采集。然后各组随机取3只大鼠用于免疫组织化学染色，其余用于RT-PCR和Western印迹检测。

用于免疫组化的大鼠麻醉后仰卧用解剖针固定四肢于蜡盘上，沿体中线剪开胸腹腔，眼科剪剪开心包膜暴露出心脏。将灌流针穿入左心室，同时剪开靠近右心房的体静脉，先以40 ml/min流速灌入200 ml 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH为7.4)，再以20 ml/min灌入200 ml 4℃ 4%多聚甲醛溶液。开颅取脑，借助脑模具冠状截取A 1.25至A 1.5之间右脑组织块，置于4%多聚甲醛4℃固定24 h，0.02 mol/L PBS漂洗3次，冲掉固定液以防止脱片。最后4℃下依次在12.5%和25.0%的蔗糖溶液中沉糖脱水，以备切片。

用于RT-PCR和Western印迹检测的大鼠，断颈处死取右脑侧端脑进行低温匀浆，-80℃保存备用。

1.4.6免疫荧光双重标记染色检测大鼠脑组织中Sox2和GFAP染色细胞数 从蔗糖溶液中取出脑组织块进行冠状冰冻切片(样品头-22℃，切片室-19℃，切片厚度30 μm)。将切片用PBS冲洗后使用0.1%曲拉通打孔，PBS冲洗，5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min，甩掉封闭液，加一抗(稀释比例均为1∶100)4℃过夜后，加PBS在脱色摇床上洗掉未附着一抗，滴加荧光二抗孵育1 h，PBS洗去未附着二抗，然后用抗淬灭封片剂封片。荧光显微镜下随机选择3个视场拍照。采用ImageJ15.1软件进行分析。将图像变为16位灰度图像后，对发荧光部分进行阈值填充，使用细胞计数工具对染色细胞进行计数。

1.4.7RT-PCR检测大鼠脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 取0.5 g组织匀浆，加入核酸提取液富集总RNA，260/280法确定RNA丰度符合PCR要求后，使用cDNA试剂盒在RT-PCR仪上合成cDNA。参比为GADPH，采用2-ΔΔCq法计算mRNA含量。引物合成服务由上海生工生物工程股份有限公司提供。HIF-1：正向序列：5′-TGA ACA TCA AGT CAG CAA CG-3′,反向序列：5′-CAC AAA TCA GCA CCA AGC AC-3′;VEGF：正向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′,反向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′;Notch1：正向序列：5′-GAC CGT GTG GCT TCC TTC TA-3′,反向序列：5′-GTT GGT GTC GCA GTT GGA G-3′;GADPH：正向序列：5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′,反向序列：5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

1.4.8ELISA测定大鼠脑脊液中VEGF含量 将脑脊液样本和ELISA试剂盒室温平衡20 min。校准品复孔。参考说明书，加注样品稀释液后每孔加入校准品或样品25 μm，微孔板振荡器快速振荡2～3 s贴封板膜37℃温箱孵育，洗板3次，拍干后加入酶标抗体孵育，再洗板拍干，加入TMB室温显色5 min后加入终止液终止显色。显色过程控制本底。酶标仪450 nm下测各孔吸光度。获得标准曲线后，反推样本VEGF浓度。

1.4.9Western印迹检测大鼠脑组织中HIF-1α、Notch1蛋白表达量 向1.4.5剩余组织匀浆中加入蛋白提取液，冰块上静置1 h。4℃ 8 000 r/min离心15 min，BCA试剂盒检测蛋白富集程度。之后进行电泳转膜。BSA封闭后，加入一抗二抗孵育。ECL显色后，使用凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS2.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1大鼠神经功能评分 与假手术组神经功能评分〔(0.00±0.00)分〕相比，模型组〔(4.32±0.13)分〕显著升高(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组〔(3.44±0.27)分〕、通脉活血汤低、中、高剂量组〔(3.92±0.13)、(3.75±0.18)、(3.51±0.20)分〕神经功能评分显著降低(P<0.05)，且通脉活血汤各组随着剂量的升高神经功能评分依次降低(P<0.05)；与抑制剂组相比，通脉活血汤低、中剂量组神经功能评分显著升高(P<0.05)，通脉活血汤高剂量组神经功能评分差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2免疫荧光双重标记染色检测大鼠脑组织中Sox2、GFAP染色细胞数 与假手术组相比，模型组Sox2、GFAP染色细胞数显著降低(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组、通脉活血汤低、中、高剂量组Sox2、GFAP染色细胞数显著升高(P<0.05)，且通脉活血汤各组随着剂量的升高Sox2、GFAP染色细胞数依次升高(P<0.05)；与抑制剂组相比，通脉活血汤低、中剂量组Sox2、GFAP染色细胞数显著降低(P<0.05)，通脉活血汤高剂量组Sox2、GFAP染色细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表1。

Sox2染色细胞在630 nm激发光下发出红色荧光，GFAP染色(Cy3)细胞在552 nm激发光下发绿色荧光，Sox2与GFAP重叠发黄色荧光图1 各组脑组织Sox2、GFAP免疫组化染色(×50)

表1 各组脑组织Sox2、GFAP染色细胞数

2.3RT-PCR检测大鼠脑组织中HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 与假手术组相比，模型组脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组、通脉活血汤低、中、高剂量组脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平显著降低(P<0.05)，且通脉活血汤各组随着剂量的升高HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平依次降低(P<0.05)；与抑制剂组相比，通脉活血汤低、中剂量组脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平显著升高(P<0.05)，通脉活血汤高剂量组脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组脑组织HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA及HIF-1α、Notch1蛋白表达水平比较

2.4ELISA检测脑脊液VEGF水平 与假手术组脑脊液中VEGF水平〔(5.21±0.21)pg/ml〕相比，模型组〔(15.15±3.14)pg/ml〕显著升高(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组〔(8.25±1.31)pg/ml〕、通脉活血汤低、中、高剂量组〔(12.45±2.12)、(9.52±1.21)、(7.44±1.18)pg/ml〕显著降低(P<0.05)，且通脉活血汤各组随着剂量的升高脑脊液中VEGF水平依次降低(P<0.05)；与抑制剂组相比，通脉活血汤低、中剂量组脑脊液中VEGF水平显著升高(P<0.05)，通脉活血汤高剂量组脑脊液中VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5Western印迹检测大鼠脑组织中HIF-1α、Notch1蛋白水平 与假手术组相比，模型组HIF-1α、Notch1蛋白水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组、通脉活血汤低、中、高剂量组HIF-1α、Notch1蛋白水平显著降低(P<0.05)，且通脉活血汤各组随着剂量的升高HIF-1α、Notch1蛋白水平依次降低(P<0.05)；与抑制剂组相比，通脉活血汤低、中剂量组HIF-1α、Notch1蛋白水平显著升高(P<0.05)，通脉活血汤高剂量组HIF-1α、Notch1蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

1～6:假手术组，模型组，抑制剂组，通脉活血汤低剂量组，通脉活血汤中剂量组，通脉活血汤高剂量组图2 各组脑组织HIF-1α、Notch1 Western印迹条带比较

3 讨 论

HIF-1是组织应对低氧最先表达的一种因子，由α和β两种亚基组成，其中前者决定HIF-1转录活性。HIF-1α能够与VEGF分子中的缺氧反应部件特异性结合，增加其稳定性，从而正向调节VEGF的转录表达。Notch蛋白家族是一类进化上高度保守跨膜蛋白。VEGF与其受体结合后，引起Notch信号通路配体的表达〔9〕。Notch发挥作用时，与胞外相应配体结合后会水解释放胞内部分，Notch胞内部分能够进入细胞核发挥转录因子作用，影响细胞形态发生。脑缺血再灌注等极端条件下，组织细胞中HIF-1α病理性高表达从而引起VEGF和Notch1的异常升高，这种病理性的升高可能并不利于神经功能的保护。Sun等〔10〕研究指出miRNA-210激活HIF-1α-VEGF途径会导致大鼠神经元细胞凋亡。Wang等〔11〕指出HIF-1α升高可通过HIF-VEGF途径影响水通道蛋白4活性从而加重脑水肿和血脑屏障破坏。有研究指出HIF-1α病理性升高能影响核转录因子(NF)-κB炎症通路从而加重细胞凋亡〔12〕。促进VEGF升高虽然有利于新血管生成、对脑血管内皮保护作用，但VEGF病理性高表达容易诱导生成不成熟、易渗漏的微血管，其渗出物反而会进一步加重周围正常神经细胞的炎症反应〔13,14〕。Herrick等〔15〕研究表明Notch1高表达会使NSCs保持休眠。Contreras等〔16〕研究表示果蝇视叶NSCs中Notch1异常高表达会使其向祖细胞转化。急性期减弱Notch信号通路能促进NSCs增殖、向神经元、星形胶质细胞等分化，从而有利于神经修复〔17〕。Hao等〔18〕指出在脑卒中亚急性期抑制Notch1可促进内源性神经发生和轴突重组。在一定程度上调Notch有利于NSCs增殖，但Notch1病理性升高可能会使Notch趋于休眠保护状态，不利于NSCs增殖。因此在下调病理状态下的HIF-VEGF-Notch通路可诱导NSCs增殖分化，从而起到神经保护的作用。Sox2是NSCs特异性标志物，而GFAP则在星形胶质细胞和NSCs细胞中表达。因此可以通过Sox2和GFAP荧光双标染色来观察大鼠脑组织中NSCs增殖和分化情况〔19〕。中医认为FCIRI属于“风、火、痰、瘀”，血瘀内停，痹阻脑络，脑失所养，筋脉失于濡养而发病。本研究所用通脉活血汤中当归、丹参、川芎、鸡血能够补血化瘀、行气通滞的功效，其余各药也均有通经活络的作用，对症下药以解诸症。

本研究显示，抑制剂组神经功能评分、脑组织中Notch1、VEGF和HIF-1 mRNA水平、脑脊液中VEGF水平、脑组织中HIF-1α和Notch1蛋白水平比模型组和通脉活血汤低、中剂量组低，这可能是因为YC-1特异性地抑制HIF-1α，从而下调VEGF和Notch1水平。Na等〔20〕研究结果表明YC-1有抑制反应性胶质细胞和神经保护的作用。Shen等〔21〕也指出YC-1通过抑制HIF-1α与MMP-2和VEGF相互作用，降低血脑屏障损伤。本研究结果说明高剂量的通脉活血汤有YC-1样作用，推测通脉活血汤也可能通过其他调节通路进一步促进NSCs增殖分化。

综上，在MCAO大鼠治疗过程中，通脉活血汤可能通过影响HIF-VEGF-Notch通路，改善病理性NSCs休眠，来促进NSCs增殖分化，从而起到神经保护的作用。实验设计没有对HIF-VEGF-Notch下游Notch1信号途径的多样性展开进一步探讨是本研究的不足之处。