老年膝骨性关节炎患者外周血miR-155和NLRP3表达的关系

张健 焦永伟 王响 任伟亮 杜双庆 齐立卿

(河北省中医院骨三科，河北 石家庄 050000)

老年膝骨性关节炎(KOA)以关节软骨损害为主要特征，常见有膝关节骨质增生、软骨下骨硬化、疼痛等特性，可导致老年人下肢功能障碍〔1〕，影响老年人日常起居和生活质量。微小RNAs(miR)是一类新发现的调节基因，其中miR-155在造血、炎症、免疫、肿瘤、肌肉发育及脂肪分化等功能中均发挥重要作用〔2〕，且高表达miR-155对促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α生成发挥正调控作用〔3〕。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRP)3炎性体是一种存在于细胞胞质中的多蛋白复合物，被激活后可以活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1，进而诱导白细胞介素(IL)-1和IL-18等细胞因子生成与分泌、介导TNF-α引起的炎症反应，调控机体炎性反应〔4〕，但miR-155、NLRP3在KOA中表达情况尚不清楚，因此本研究通过观察miR-155、NLRP3在老年KOA患者中表达水平，并联合TNF-α探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年2月至2019年8月经河北省中医院确诊治疗的48例老年KOA患者作为观察组，其中男22例，女26例，年龄60～78岁，平均年龄(70.81±6.79)岁；同期选取50例体检健康老年人群作为对照组，其中男27例，女23例，年龄60～79岁，平均年龄(70.95±7.06)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。观察组纳入标准：①符合中华医学会骨科分会《骨关节炎诊治指南(2007版)》中KOA诊断标准〔5〕；②临床资料完整。排除标准：①合并心血管系统疾病、肝脏疾病；②痛风病史；③感染及自身免疫性疾病；④长期服用补钙药物；⑤合并恶性肿瘤。根据磁共振成像(MRI)检查结果进行分级，采用软骨病变MRI分级标准即Recht标准〔6〕：Ⅰ级，软骨分层结构消失，骨内出现局灶性低信号区，软骨表面光滑；Ⅱ级，软骨表面轮廓轻至中度不规则，软骨缺损深度未及全层厚度的50%；Ⅲ级，软骨表面轮廓中至重度不规则，软骨缺损深度达全层厚度的50%以上，但未完全脱落；Ⅳ级，软骨全层缺损、剥脱，软骨下骨质暴露，有或无软骨下骨质信号改变。其中Ⅰ级27例，Ⅱ级13例，Ⅲ级8例。本研究通过河北省中医院伦理委员会批准。受试对象及其家属均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器 人TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海传秋生物科技有限公司；Hettich离心机(ROTOFIX32A)购自德祥科技有限公司；海尔-20℃冰箱(HYCD-282)购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；Wealtec PCR仪(1310001)购自北京威泰克有限公司；Quawell超微量紫外分光光度计(Q3000)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3样品采集 所有受试人员空腹>8 h，均于清晨采集静脉血5 ml，3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清样本置于Eppendrof管中，于-20℃冰箱保存。

1.4qRT-PCR测定血清中miR-155、NLRP3表达水平 从-20℃冰箱取出血清样本，用Trizol试剂提取血清总RNA，异丙醇沉淀浓缩后，用75%酒精洗涤，干燥后加入100 μl 焦碳酸二乙酯(DEPC)水，检测所得RNA纯度及完整度。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，于-20℃保存。反应体系共25 μl，包括SYBR Green Mix 9 μl，模板cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，无RNA酶水补足至25 μl。miR-155以U6为内参，反应程序为95 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40个循环。NLPR3以β-actin为内参，反应条件为95 ℃ 5 min，94℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环。引物由武汉博欧特生物科技有限公司设计并合成，引物序列。U6正向CTTAGTTGCATGCAG，反向AATCGTGTATAAGTC；miR-155正向GTCCCAATGCTGTCT，反向GGAAGTTGCATGCAT；β-actin正向GTAGTTTCGTGGATGCCACAG，反向GAGCTACGAG CTGCCTGACG；NLRP3正向CCCCGTGAGTCCCATTA，反向GACGCCCAGTCCACAT。采用2-ΔΔCt法计算血清中miR-155、NLPR3 mRNA相对表达量。

1.5ELISA法测定血清中TNF-α表达水平 从-20℃冰箱中取出血清样本，采用ELISA法检测血清中TNF-α表达水平，严格按试剂盒说明书操作。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0软件进行t检验、方差分析、LSD-t检验和Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达水平比较 观察组血清中miR-155、TNF-α表达水平明显高于对照组，NLRP3表达水平明显低于对照组(P<0.001)。见表1。

表1 两组血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达水平比较

2.2老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达的相关性 老年KOA患者血清中miR-155与NLRP3表达呈负相关(r=-0.689，P<0.05)，miR-155与TNF-α表达呈正相关(r=0.540，P<0.05)，NLRP3与TNF-α表达呈负相关(r=-0.513，P<0.05)。见图1。

图1 两组血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达的相关性

2.3不同级别老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达水平比较 与Ⅰ级相比，Ⅱ级、Ⅲ级老年KOA患者血清中miR-155、TNF-α表达水平明显升高，NLRP3表达水平明显降低(P<0.05)；与

Ⅱ级相比，Ⅲ级老年KOA患者血清中miR-155、TNF-α表达水平明显升高，NLRP3表达水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 不同级别老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表达水平比较

2.4血清中miR-155、NLRP3表达对KOA的诊断价值 受试者工作特征(ROC)曲线显示，miR-155诊断KOA的ROC曲线下面积为0.925(95%CI：0.857～0.993)，截断值为2.233，敏感度为89.6%，特异性为96.0%；NLRP3诊断KOA的ROC曲线下面积为0.800(95%CI：0.714～0.886)，截断值为67.568，敏感度为79.2%，特异性为68.0%；miR-155、NLRP3联合检测诊断KOA的ROC曲线下面积为0.930(95%CI：0.865～0.995)，敏感度为91.7%，特异性为94.0%。见图2。

图2 miR-155、NLRP3诊断KOA的ROC曲线

3 讨 论

近年KOA患者血液检测指标逐渐得到重视，Kucharz等〔7〕、Attur等〔8〕认为炎性血浆脂质生物标志物前列腺素(PG)E2和15-羟基二十碳四烯酸(HETE)可识别有症状KOA患者，而外周血淋巴细胞(PBL)炎性转录组可识别出部分有症状KOA患者。Daghestani等〔9〕认为可溶性巨噬细胞生物标志物如可溶性血红蛋白清道夫受体163蛋白(sCD163)和可溶性白细胞分化抗原(sCD)14可指示KOA患者炎症表型。TNF-α被研究学者认为是调节KOA发病的重要炎症介质，在KOA病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏〔10〕。王艳荣等〔11〕研究发现KOA患者滑液中TNF-α水平呈高表达，并随着临床分期增加其含量逐渐上升。Yang等〔12〕研究发现，痛风小鼠模型中miR-155表达升高，单钠尿酸盐(MSU)晶体诱发的腹膜炎小鼠中炎性细胞因子产生明显增加，miR-155过表达导致抑制SH2区域的肌醇5'磷酸酶(SHIP)-1水平并增强促炎细胞因子，认为miR-155对于人类骨髓细胞促炎激活和抗原驱动的关节炎至关重要。Teramura等〔13〕通过尸检发现miR-155与KOA炎症相关，且可能导致干细胞耗竭。穆尚强等〔14〕研究发现KOA患者关节液中miR-155表达量上调≥2倍，认为其表达变化可能与KOA发病有关。本研究提示miR-155在KOA进程中呈高表达，推测miR-155高表达可能增强TNF-α等促炎细胞因子表达，加重炎症伤害。

虽然IL-1β和IL-18在关节炎中的致炎和损伤软骨及骨组织的作用已经被肯定，但其上游调控分子NLRP3的作用却具争议性。Shi等〔15〕研究发现关节间隙脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)增加可能通过NLRP3炎性小体促进膝骨关节炎发展，而雌二醇(E2)似乎通过雌激素受体β降低NLRP3 mRNA和蛋白水平来抑制NLRP3炎性体激活。Kim等〔16〕认为活动性类风湿关节炎患者外周血细胞中NLRP3炎性小体活性增强。另有研究者认为NLRP3在类风湿关节炎患者粒细胞中mRNA表达水平明显低于对照组，推测其炎性小体信号通路是炎症反应过程中的保护因子〔17〕。本研究结果表明NLRP3在KOA进程中呈低表达状态，推测其可能在炎症应激过程中起保护作用。

miR-155、NLRP3、TNF-α可能共同参与KOA发生发展，且三者表达均与KOA病症程度相关。Pearson相关性分析结果表明在KOA发生发展过程中miR-155可能促进和激活TNF-α分泌，而NLRP3炎性小体抑制TNF-α表达，猜测在炎性应激反应中NLRP3发挥对机体的保护作用。ROC曲线分析结果表明miR-155、NLRP3对KOA均具有较好的诊断价值，且联合检测诊断价值更高。