尿液miRNA 检测在膀胱癌诊断中的价值

杨碧锋 袁霞妹 张文宝

(浙江金华广福肿瘤医院，浙江 金华 321000)

膀胱癌是泌尿系最常见的肿瘤之一，其死亡率排在泌尿系肿瘤的第二位〔1〕。常用于膀胱肿瘤相关检查的项目有膀胱镜检查、盆腔影像学、血清肿瘤标志物、尿沉渣脱落细胞检查等，但这些方法存在侵入性、操作难、敏感性和特异性低等缺点〔1〕，因而临床上需要寻找更有价值的诊断标志物。miRNA是一种非编码的单链RNA，对细胞转移、凋亡、增殖和迁移等功能有显著影响，对人类1/3的基因起调控作用〔2〕，其异常表达在许多肿瘤中(包括膀胱癌)已被证实〔3，4〕。本研究基于以往基因芯片数据分析，膀胱癌高通量测序结果及对膀胱癌miRNA的研究，选择表达差异显著且稳定性、特异性佳的miRNA，探索其在膀胱癌诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1研究对象 选取2016年1月至2018年12月浙江金华广福肿瘤医院收治的接受膀胱癌手术的患者30例为病例组，收集患者的临床资料、术前尿液、术后癌组织和癌旁正常组织病理标本。所有患者经尿道膀胱肿瘤电切术或膀胱全切术，术中和术后病理均明确诊断为膀胱癌。男23例，女7例，平均年龄(55.38±7.29)岁，T1期21例，T2期6例，T3期3例，排除标准：①术前曾接受过化疗、放疗或免疫治疗者；②合并有其他肿瘤患者；③合并有泌尿系其他疾病患者；④合并有其他重要脏器严重疾病者；⑤膀胱癌再发者。入选同期30例健康体检者(对照组)的尿液。对照组男20例，女10例，平均年龄(56.24±7.34)岁。两组年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获医院医学伦理学会批准，所有研究对象签署知情同意书并自愿参加。

1.2标本采集 术前膀胱癌患者及健康体检者均留取清晨尿液样本15 ml，置于-80℃冰箱中保存待检，收集尿液之前3 d患者未进行任何侵入性操作(包括膀胱镜、尿道冲洗等)。术中标本离体后采集新鲜膀胱癌组织标本及相应正常黏膜组织标本，所有新鲜标本立即放入液氮中冻存30 min后转至-80℃冰箱中保存待检。

1.3检测方法 根据既往膀胱癌高通量测序及基因芯片数据分析结果及文献对于膀胱癌miRNA的研究报道，选择以下10个miRNA进行研究：miRNA-20a、miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a、miRNA-8085、miRNA-137、miRNA-143、miRNA-96、miRNA-451及miRNA-212。从美国国家生物技术信息中心官方网站上查询相应miRNA序列，委托北京天根生物有限公司合成所需引物。使用天根miRcute miRNA荧光定量检测试验盒(FP401)进行荧光定量PCR，严格根据说明书进行操作，以U6作为内参物，每个样本做3个重复采用2-△ct法检测基因表达量。

1.4统计学方法 使用SPSS22.0软件进行t检验，绘制受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.1癌组织和癌旁组织中各miRNA的表达差异 膀胱癌患者癌组织中的miRNA-20a和miRNA-21相对表达量均显著高于癌旁正常组织，miRNA-129、miRNA-133a、miRNA8085、miRNA-451及miRNA-143相对表达量均显著低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2膀胱癌患者尿液样本与健康体检人群尿液标本中各miRNA表达差异比较 膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相对表达量显著高于健康体检人群，miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相对表达量显著低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 癌组织与癌旁正常组织及膀胱癌患者与体检者尿液中各miRNA表达

2.3各尿液miRNA对膀胱癌的诊断价值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143的AUC较大。见表2。

表2 各尿液miRNA对膀胱癌的诊断价值

2.4尿液miRNA两两组合对膀胱癌的诊断价值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143等两两组合后AUC均>0.9，其中miRNA-133a+miRNA-143组合的AUC达到0.994，敏感性和特异性是0.975、0.925。见表3。

表3 miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143两两组合对膀胱癌的诊断价值

3 讨 论

临床膀胱癌的诊断几乎全部依赖于侵入性的膀胱镜检查和组织病理学。但是，膀胱镜检查有创伤性，且费用昂贵，并不适用于大规模人群的筛查。盆腔影像学检查也不能发现早期的膀胱癌。许多膀胱癌的肿瘤标志物(如：纤维连接蛋白、膀胱肿瘤抗原)敏感性和特异性均差强人意。尿沉渣细胞中的RNA虽然主要来源于肿瘤细胞，但容易受到各种因素的影响〔5〕，因此也不适用于膀胱癌的诊断。尿上清液中的RNA来源于尿液外泌体和循环中的miRNA，因其受到RNA酶的影响小，所以其理化性质稳定、成分稳定〔6，7〕。Yamada等〔8〕研究发现在尿路上皮细胞癌患者尿液中miRNA-96和miRNA-183的表达水平显著高于健康体检者，尿路脱落细胞中miRNA-96的表达水平与尿路上皮细胞癌的临床特性高度相关。Shi等〔7〕研究也有类似发现。因此尿液miRNA可作为膀胱癌诊断的标志物。

本研究研究对象的尿液、膀胱癌组织及癌旁组织中均检测出上述miRNA，提示尿液中miRNA作为膀胱癌肿瘤标志物进行诊断是可行的。与以往的相关研究报道有一定的相似性〔9，10〕。另外在本研究中还发现膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相对表达量高于健康体检人群，而miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相对表达量则低于健康体检人群(均P<0.05)，这与国内外的某些研究结果相似〔11，12〕。既往研究表明〔13〕，单个miRNA基因检测对疾病诊断的敏感性较低，而联合检测多次miRNA基因可显著提高检测的阳性率。

综上，联合检测miRNA-129和miRNA-143的相对表达量对膀胱癌具有较好的诊断价值。