人源诱导多能干细胞分化神经元的发育动力分析

陈晓霞, 邓艳芳, 陈舒婷, 师玲玲，*

(1. 南方医科大学 细胞生物学教研室, 广东 广州 510515； 2. 暨南大学 附属第一医院 精神医学科, 广东 广州 510630;3. 暨南大学 粤港澳中枢神经再生研究院, 广东 广州 510630)

在神经系统发育过程中，产生于室管膜层和亚室管膜层的神经元需要迁移到特定的大脑区域发挥作用.神经元的正常迁移对脑回路的正常发育以及正常的脑功能活动至关重要[1].神经元正常迁移和迁移轨迹是细胞外因子和细胞内信号级联调控的结果，由神经元迁移异常导致的各种脑回路畸形和功能障碍是多种神经发育障碍疾病的重要病因，包括癫痫[2]、阅读障碍[3]和自闭症谱系障碍[4].临床脑成像、神经病理研究和动物模型表明[5-7]，神经元迁移异常是自闭症大脑异常的重要特征，对神经元迁移异常进行治疗干预成为自闭症潜在的治疗手段.

相关研究者通过提取动物原代神经元进行神经元迁移体外研究[8]，但是该模型不能完全模拟人类遗传背景和反应完整神经发育过程.诱导多能干细胞[9](induced pluripotent stem cells，iPSC)分化神经元模型可以从神经前体细胞(neural precursor cells，NPC)贴壁开始监控神经元生长和运动，模拟神经发育早期神经元迁移情况.然而不同发育时期神经元胞体和突起运动的研究还未见报道，不同分化阶段神经元的动力参数尚未有明确描述.

本研究拟建立人iPSC模型对神经元动力进行研究，并对神经元动力行为进行表征，探究不同发育时间点对神经元胞体和突起运动的影响，为自闭症等神经元发育障碍疾病来源的iPSC模型的神经元动力研究提供参考.

1 材料和方法

1.1 细胞系和培养条件

人iPSC从人类外周血单核细胞(periphera blood mononuclear cell，PBMC)重编程诱导而来，购买于广州中科院健康所.iPSC在一定条件下能诱导成神经干细胞，进而分化为神经元.细胞放入培养箱培养，培养条件为37 ℃，体积分数为5%的CO2.

1.2 方法

1.2.1 iPSC的培养和诱导

iPSC贴壁生长在基质胶包被过的六孔板，每日换液，培养液为mTesR.当细胞密度达到80%左右传代至基质胶包被过的12孔板(1∶1)，消化液浓度为0.5 mmol/L EDTA.培养液为N2B27+2i(N2B27培养液：质量分数分别为48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、0.5%的Insulin、0.5%的NEAA、0.5%的GlutaMAXTM、0.1%的2-Mercaptoethnol、0.1%的Heparin，2i浓度为5 μmol/L SB431542和Drosomophorim).第0～8天，每隔2 d换一次液(避光).

第8天，将12孔板中的细胞传代至基质胶包被过的六孔板中，小枪头机械切割传代，培养液为N2B27.第8～16天，每2 d换一次液.

第16天，将六孔板中的细胞传代至T25瓶，大枪头机械切割传代，悬浮培养.培养液为N2B27+EGF+bFGF(质量分数分别为48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、质量浓度分别为20 μg/L的EGF和20 μg/L的bFGF).待小球长到足够大，用Accutase进行传代，消化时间约为15 min.

1.2.2 神经元的感染

神经小球传到第2代，用Accutase将神经小球消化为单细胞，进行细胞计数，RFP(吉凯基因，货号为GCPL40194，滴度为1.38×106TU/mL)慢病毒进行感染(悬浮感染4 μL/250万细胞)，细胞感染6 h后，1 000 r/min，5 min离心，弃病毒液，用N2B27+EGF+bFGF重悬，悬浮培养.培养2 d后，将感染后的神经小球消化为单细胞，种于基质胶+星形胶质细胞包被过的铺有玻片的24孔板.培养液为N2B27+BDNF+cAMP(质量分数分别为48.3%的DMEM/F-12、49%的Neurobasal、0.5%的N2、1%的B27、质量浓度为20 μg/L的BDNF、浓度为1 μmol/L的cAMP).收集神经元发育过程第5天和第15天的细胞，用于神经元形态学和神经元动力分析.

1.2.3 细胞免疫荧光

取24孔板中培养到实验设计天数的细胞(iPSC、NPC、神经元)，PBS洗1遍，质量分数为4%的PFA固定15 min；PBS洗1遍，质量分数为3%的BSA封闭液室温封闭1 h，一抗稀释液(质量分数为1%BSA配制)4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，二抗稀释液室温避光孵育1.5 h；PBS洗3次；封片，用共聚焦荧光显微镜拍照.

1.2.4 细胞动力行为分析

表1 Image J分析得到单个神经元动力数据Table 1 Analysis of neuron motility from Image J

2 结果

2.1 体外神经发育模型的构建

通过Dorsomorphim和SB4315242抑制 SMAD信号通路使 iPSC(图1 A)体外定向诱导为NPC及再分化为神经元(分别见图1D，图1 G).iPSC克隆大部分呈圆形，细胞紧密排列，边界清晰，状态较好；iPSC体积较小，细胞核大，细胞核内有1～2个核仁，核仁清晰，核/质比高，符合iPSC典型特征.对iPSC进行免疫荧光鉴定，iPSC OCT4、SSEA4染色为阳性(图1 B、图1 C)，证明了iPSC具有多项分化潜能；对NPC进行免疫荧光鉴定，NPC SOX2染色为阳性(图1 E)，证明了iPSC成功诱导为NPC；为了更好地标记神经元的形态和运动，对NPC进行RFP慢病毒感染.图1 G为NPC贴壁培养到12 d的神经元，神经元胞体和突起均有较强的红色荧光.对神经元进行免疫荧光鉴定，神经元MAP2染色为阳性(图1 H)，证明了NPC成功分化为神经元，并且MAP2能够特异标记神经元树突，说明神经元在培养12d时已经出现明显的极化.

2.2 不同发育时期神经元胞体动力分析

神经元迁移有3个步骤：生长锥感知微环境，神经元前缘(leading edges)延伸；细胞核易位或分裂；后缘(trailing edges)收缩[10].其中细胞核移位是神经元迁移的主导过程，表现为神经元胞体移位.因此本组对不同发育时间神经元胞体进行动力分析.取NPC贴壁分化到第5天的神经元(早期)和第15天的神经元(中晚期)进行神经元胞体动力分析，记录0～5 h内神经元胞体的移位.图2 A为培养到第5天神经元每小时胞体位置的记录，图中箭头标记的神经元5 h内向左上方运动，运动距离较长；图2 B为培养到第15天神经元每小时胞体位置的记录，图中箭头标记的神经元5 h内向右上方运动，运动距离较短.使用Image J的手动跟踪插件记录两组神经元胞体运动，得到两组神经元胞体运动速度数据，统计结果显示与第15天神经元相比，第5天神经元胞体5 h内运动速度显著提高(图2 C)，运动方向性没有差异(图2 D)；将两组细胞0、1、2、3、4、5每小时胞体运动速度进行统计分析发现(图2 E)，在第1小时，第5天神经元胞体运动速度显著提高，而在第2、3、4、5小时，两组神经元运动速度无统计学差异.研究结果表明发育过程中神经元胞体运动速度明显下降.

A：iPSC(×40)；B：iPSC细胞核表达OCT4(×20)；C：iPSC细胞核和细胞质表达SSEA4(×20)； D：NPC(×40)；E-F：NPC表达SOX2(×20,NPC特异性标志物)；G：神经元(×20)；H-I：神经元表达MAP2(×20,神经元树突特异性标志物).比例尺：50 μm.

2.3 不同发育时期神经元胞体运动轨迹分析

为了进一步分析不同发育时期神经元的运动轨迹，本组使用Image J的手动跟踪插件记录两组每个神经元胞体运动，得到两组单个神经元5 h内胞体坐标轴数据(表1 XY坐标轴).将0 h的XY轴数据标准化为原点(0，0)，得到1、2、3、4、5 h新的坐标轴位置，用EXCEL作图，得到两组细胞运动轨迹图(n=17).结果表明总体上第5天神经元运动距离更长，移动方向更加随机(图3)，说明发育早期神经元运动距离更长，运动方向更随机.

A-B：活细胞工作站分别记录培养第5天和第15天神经元0、1、2、3、4、5 h图像(×20)，比例尺：20 μm；C：神经元胞体运动速度(第5天，n=27；第15天，n=41)；D：神经元胞体运动方向性(第5天，n=27；第15天，n=41)，检验方法：t检验；E：神经元胞体每小时运动速度(n=21).检验方法：Two-way ANOVA. 1)P<0.001.

图3 不同发育时期神经元胞体运动轨迹

2.4 不同发育时期神经元突起动力分析

在神经元发育过程中，通过生长锥感知微环境，神经元突起可以沿着特定路线生长延长，与靶细胞或神经元的胞体、突起建立突触联系[11].因此本组对不同发育时间神经元突起进行动力分析，主要研究神经元突起形成消除和突起生长坍塌修剪过程，神经元突起形成消除是指经元突起数量的增加和减少；神经元突起生长坍塌修剪是指神经元突起长度增加和减少.

图4 A和图4 B为活细胞工作站分别记录培养第5天神经元和第15天神经元0、1、2、3、4、5 h的细胞图像和跟踪图像；跟踪图像中，红色的是胞体，蓝色的是一级突起，绿色的是二级突起.通过对两组神经元突起进行动力分析，发现不同发育时期神经元一级突起形成和消除速度没有区别(图4 C-E)；但是与第15天神经元相比，第5天神经元一级突起生长和坍塌修剪速度显著提高(图4 F-H)，表明发育早期神经元突起运动更加活跃，这与发育早期神经元胞体运动速度更快相一致.为了探究神经元胞体动力与神经元突起长度、数量、胞体面积的联系，本组统计了两组神经元0、1、2、3、4、5 h突起长度和数量，胞体面积的变化，结果发现第5天神经元突起总长度明显降低(图4 I)，突起总数量明显提高(图4 J)，胞体面积的变化率没有差异(图4 K).

A-B：第5天和第15天神经元图像和标记图(×20)，比例尺：50 μm；C：神经元一级突起形成速度(第5天，n=38；第15天，n=19)；D：神经元一级突起消除速度(第5天，n=20；第15天，n=22)；E：将0 h神经元一级突起数量标准化为1，得到1、2、3、4、5 h神经元一级突起的形成/消除速度(n=20)，大于1表示形成，小于1表示消除；F：神经元一级突起生长速度(n=38)；G：神经元一级突起坍塌修剪速度(n=60)；H：将0 h神经元一级突起长度标准化为1，得到1、2、3、4、5 h神经元一级突起长度的生长/坍塌修剪速度(n=20).大于1表示生长，小于1表示坍塌修剪；I：突起总长度(n=20)；J：突起总数量(n=20)；K：胞体面积变化(n=20). 1)P<0.05， 2)P<0.01，3)P<0.000 1.

3 讨论

在早期神经发育过程中，神经元正常迁移为突触连接和功能性神经环路的形成奠定了基础[12-13].神经元迁移异常是许多神经发育障碍疾病的重要病因[14-16].研究者通过对癫痫、自闭症患者进行临床脑成像和神经病理学研究，发现癫痫、自闭症患者脑结构存在神经元迁移异常特征，比如：局灶性厚脑回和皮层、脑室周围、海马和小脑异位；另外不同研究通过构建自闭症易感基因敲除小鼠模型[6]，发现在自闭症小鼠大脑切片和原代神经元中均观察到神经元迁移异常，提示神经元迁移的异常调节可能导致自闭症临床表型的机制之一.因此目前迫切需要一个合适的模型对神经元迁移进行研究和干预.相关研究神经元迁移异常的动物模型不能完全模拟人类遗传背景，研究结果难以直接指导临床治疗；同时不能很好地模拟胚胎时期神经元迁移情况，难以反映完整神经发育过程.iPSC的出现很好地解决了这个问题，采用人源iPSC来源神经发育模型可以模拟人类遗传背景，同时克服了成体细胞无法再现神经发育过程的问题. Kathuria等[17]取iPSC分化到48 h神经元，通过活细胞记录发现SHANK3基因突变的神经元存在神经元动力不足.目前已有相关研究报道人源性神经发育模型进行神经元迁移的研究，多数研究直接选取神经发育过程中的某个时间点进行实验，忽略了神经发育过程中神经元动力差异，不同分化阶段神经元的具体动力参数也尚未有明确描述.本研究小组通过对不同发育时期神经元的动力学参数进行描述，发现在神经发育过程中，神经元胞体和突起运动逐渐缓慢，具体表现为发育早期(第5天)神经元胞体运动和一级突起生长坍塌修剪更活跃，提示如果用iPSC分化神经元对神经元动力进行研究和干预，研究选择的时间点要在发育早期.

神经元动力研究不仅要关注胞体动力，更要关注突起的生长和坍塌修剪过程、突起长度与分支数量.神经元迁移首先神经元轴突远离胞体一端的生长锥面积增大、感知探索微环境，胞体向前推移，尾部突起消失[18].神经元胞体运动是神经元迁移的主导过程，与神经发育神经嵴、神经管、胚脑和不同脑区的形成有关；神经元突起运动与神经元感知外界理化环境，引导神经元生长方向，建立神经突触结构及神经环路有关.本研究发现神经发育早期(第5天)神经元胞体运动速度显著提高，可能与发育早期神经元突起总长度降低和突起总数量提高有联系.神经元胞体的运动依赖于轴突生长锥，发育早期生长锥面积增大，通过细胞骨架中丝状伪足和板状伪足的伸长或回缩来感知微环境的变化，决定神经元运动方向[19].

本研究采用人源神经发育模型探索不同发育时期神经元胞体和突起动力学参数，综合分析发育早期和中晚期神经元5 h内胞体运动速度及每小时胞体运动速度、神经元胞体整体运动轨迹、神经元一级突起形成消除和生长坍塌修剪速度、神经元突起总长度和数量等参数，研究结果发现神经元胞体运动和突起生长坍塌修剪过程均表现出早期活跃于中晚期，本研究模型对自闭症等神经发育障碍疾病神经元动力异常的早期干预和研究提供了实验依据.

作者贡献声明

陈晓霞：设计实验，撰写论文，修改论文；邓艳芳：统计分析数据；陈舒婷：细胞培养及形态学分析；师玲玲：提出研究思路和框架，就数据分析提供建议.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.