污水厂活性污泥中厌氧氨氧化细菌的群落结构研究

喻 嘉，王易明

（1. 湖南百舸水利建设股份有限公司，湖南 长沙 410007；2. 湖南百舸水利邵阳县乡镇污水处理项目部，湖南 邵阳 422100）

前 言

厌氧氨氧化（Anammox），是指自养细菌在氧气限制条件下将氨氧化与亚硝酸盐还原耦合产生氮气（N2）的过程[1～2]。厌氧氨氧化的发现及其在污水处理上的应用给传统的废水脱氮带来了革命性的变化[3]。

大量研究证实了厌氧氨氧化在自然生态系统和人工生态系统中对脱氮的重要作用。过去十年的研究发现，厌氧氨氧化工艺在废水生物处理系统中不仅有利于去除氨氮，而且还能节约碳源和能源。目前已经开发了许多污水处理技术工艺，可以最大限度地利用厌氧氨氧化处理高浓度氨氮废水。与传统的脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺具有许多优点，例如不需要利用溶解氧从而节省能源成本， 除此之外还可以减少温室气体释放，如N2O[2，4]。由于这些特点，厌氧氨氧化工艺已在实验室模拟和实际应用中用于处理各种类型的高氮废水，如猪场废水、制革废水和垃圾渗滤液等[5～7]。

厌氧氨氧化因其过程耗氧量低、对有机碳的需求量少而被广泛应用于高浓度氨氮废水处理[8～9]。为了维持生物废水处理系统中稳定的厌氧氨氧化过程，必须提高微生物的稳定性、多样性和活性，为此要了解污水处理厂活性污泥中厌氧氨氧化微生物的群落结构及其驱动因素，因此本文采集了8 个污水处理厂的活性污泥样品，对其厌氧氨氧化的功能基因丰度、细菌群落结构以及驱动因素进行了分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集与环境因子测定

本文选取了8 个污水处理厂的活性污泥样品进行分析。样品氨氮（NH4+-N），硝氮（NO3--N）和亚硝氮（NO2--N）浓度利用流动分析仪测定。pH 值利用pH 测定仪测定。总氮（TN）、总碳（TC）和总硫（TS）浓度利用元素分析仪测定。

1.2 DNA 提取与qPCR 定量

选取8 个污水处理厂的活性污泥样品进行分析。将样品冻干后研磨过筛，使用Mobio 试剂盒提取土壤样品中的DNA（PowerSoil RDNA Isolation Kit，美国）。使用引物HSBeta396F（ARGGHTGGGGHAGYTGGAAG）和HSBeta 742R（GTYCCHACRTCATGVGTCTG）对厌氧氨氧化功能基因hzsB 利用荧光定量PCR 技术测定，获得厌氧氨氧化的绝对丰度。

1.3 高通量测序与处理

利用PCR 技术从DNA 提取物中扩增出hzsB 功能基因。经过纯化后在Illumina MiSeq 2500 平台上进行高通量测序。测序得到的hzsB 序列经过质控处理后，使用QIIMEM 等软件处理高通量序列，将处理后序列上传至NCBI 数据库中进行蛋白序列比对注释，得到厌氧氨氧化细菌群落结果。

1.4 数据处理

本文中斯皮尔曼相关性分析用于处理厌氧氨氧化丰度与理化因子的相关性， 单因素方差分析用于处理不同样品之间参数的差异性，R 和Gephi 软件用于网络图的处理与分析，主坐标分析（PCOA）用于分析不同样品间厌氧氨氧化细菌群落的相似性和差异性。

2 研究结果与讨论

2.1 理化结果

对8 个污水处理厂的活性污泥样品的理化因子进行分析，如表1 显示，氨氮（NH4+-N）浓度在所有样品中差异性不大（p>0.05），在20.65～31.60 mg/L 范围内，而硝氮（NO3--N）浓度跟NH4+-N 浓度相比起来，处于较低的水平，在4.03～15.87 mg/L 范围内；亚硝氮（NO2--N）的浓度也较低，均在1 mg/L 以下，最低为0.12 mg/L。总氮（TN）浓度在不同活性污泥样品中变化差异性较大（p<0.05），总体浓度在0.39～4.89 g/L 范围内，而总碳（TC）的浓度大于总氮，不同样品间变化差异也大，最大可达73.93 g/L。pH 范围在3.47～7.9 之间。以上结果说明，不同污水处理厂之间的活性污泥的理化性质具有差异性，这可能与各个污水处理厂污水处理的参数等有关。

2.2 厌氧氨氧化定量

针对厌氧氨氧化细菌的hzsB 功能基因对8 个污水处理厂活性污泥样品的DNA 进行荧光定量PCR 实验，结果显示如图1，厌氧氨氧化丰度变化差异性较大（p<0.05），在3.53±0.05×1010到2.51±0.01×1011copies/g VSS 范围内。丰度范围与其他污水处理厂相似[10，11]。E污水处理厂含有最大丰度的厌氧氨氧化丰度（2.51±0.01×1011copies/g VSS），而C 样点含量最低（3.53±0.05×1010copies/g VSS）。斯皮尔曼相关性结果显示，NH4+-N（p=0.002）和NO2--N（p<0.001）与丰度具有显著正相关关系。NH4+-N 和NO2--N 作为厌氧氨氧化反应的底物，其浓度的增加必然会增加其丰度，这与以往的结果相似[10]。

图1 不同污水处理厂中活性污泥中厌氧氨氧化功能基因丰度

2.3 厌氧氨氧化细菌组成和多样性

为了了解不同污水处理厂活性污泥样品中厌氧氨氧化细菌群落组成和变化，我们做了基于hzsB 功能基因的高通量测序技术实验，结果共注释到5 种厌氧氨氧化细菌种属，分别为Candidatus Brocadia sp.a，Candidatus Brocadia sp.f，Candidatus Jettenia sp.J，Candidatus Kuenenia sp.K 和Candidatus Scalindua sp.S。总体来说，OTUs 数量最多的是属于Ca.Brocadia,平均OTUs 数为69 256，显著高于其他种属（p<0.05）。

对厌氧氨氧化的多样性指数进行分析，结果显示，不同污水处理厂之间的活性污泥样品中厌氧氨氧化细菌群落的α 多样性指数差异性较大（p<0.05），如表2所示。与丰度结果类似，E 点的超（183.8），辛普森（0.91）和香农（3.01）指数都较大，然而多样性最小的点是H点，表明H 污水厂内厌氧氨氧化群落的均匀度较差。相关性结果显示，NH4+-N（p=0.002）与α 多样性指数具有显著正相关关系，这也说明NH4+-N 有利于增加厌氧氨氧化细菌的多样性。

表2 不同污水处理厂中活性污泥中厌氧氨氧化细菌的α 多样性指数

对厌氧氨氧化细菌群落的β 多样性进行分析后发现，两轴对细菌群落的解释度分别为55.1%和23.4%，总体解释度大于70%（图2）。污水处理厂A 与D 的厌氧氨氧化细菌群落结构更为相似，而C 和B，E 和F，G和H 的群落结构更为相似，四组之间差异性较大，这可能说明污水处理厂相似的运行模式下，活性污泥中厌氧氨氧化的群落结构也会更加相似。

图2 不同污水处理厂中活性污泥中厌氧氨氧化细菌的群落PCoA 图

2.4 厌氧氨氧化细菌群落间相互作用

为了了解活性污泥中厌氧氨氧化群落结构的相互作用，利用网络图做进一步分析。选取数量占比前200的OTUs 进行网络图分析，保证相关性系数大于0.8 且显著性p值小于0.05 进行分析，结果如图3 显示，主要分类到5 个模块，这些模块的节点数目占总节点的比例大于90%。总体来说厌氧氨氧化细菌群落相互作用密切，模块化指数为0.601，而且不同模块之间连接紧密，离散的节点数较少。整个网络图中Candidatus Brocadia sp. 是关键菌属，与其连接的节点数达到53个，但是不同模块中的关键菌属也具有差异，例如模块5 的关键菌属是Candidatus Jettenia sp.，而模块2 中关键菌属是Candidatus Kuenenia sp.，这可能说明在活性污泥中厌氧氨氧化各个菌属都发挥作用，但是菌种之间具有一定协同和竞争作用。以往研究对污水处理厂活性污泥絮体的研究表明，厌氧氨氧化菌多样性较低，然而Candidatus Brocadia 是绝对优势物种[11]，与本文研究相似。除此之外，对处理高氨氮废水（如垃圾渗滤液）时所用到的絮凝污泥和颗粒生物膜样品中微生物多样性分析表明，Candidatus Brocadia 在厌氧氨氧化菌群落中也占据主导地位[12～13]。然而在处理低氨生活废水时，Candidatus Jettenia 和Candidatus Kuenenia 却是优势物种。

图3 不同污水处理厂活性污泥中厌氧氨氧化细菌群落的分子生态网络分析

3 结 论

本文研究中选取了8 个不同污水处理厂的活性污泥样品，研究了厌氧氨氧化的丰度、细菌多样性、群落结构及其驱动因素，结果显示厌氧氨氧化的丰度水平较高，可达1011copies/g VSS，且不同样品间丰度分布差异性较大，厌氧氨氧化的多样性变化也较大，而氨氮浓度是这些差异的主要驱动因素。氨氮与厌氧氨氧化的丰度和多样性具有显著正相关关系，说明高氨氮废水更有利于富集厌氧氨氧化。除此之外，厌氧氨氧化细菌的群落相互作用较为密切，且Candidatus Brocadia 是优势菌属，主导厌氧氨氧化反应过程。以上结果多方面研究了不同污水处理厂活性污泥中厌氧氨氧化细菌赋存现状和其影响因素，对提高厌氧氨氧化微生物在污水处理系统中稳定性、多样性和活性具有参考意义。