米曲霉固态发酵苏麻饼粕产抗氧化肽工艺优化

龙久铃，朱秋劲，白晶，陈玉芹，杨睿颖,余顺波，叶春

1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省农业科学院 油菜研究所, 贵州 贵阳 550008

0 引言

苏麻(PerillafrutescensBritt. var.frutescens)，系唇形科紫苏属一年生草本自花授粉植物，是一种优质的药食两用特色植物[1].苏麻饼粕是苏麻籽榨油后剩余的副产物，其蛋白质含量较高，氨基酸种类丰富，含有人体所需的8种必需氨基酸，是一种良好的植物蛋白资源[2].目前，油脂企业产生的大量苏麻饼粕加工利用途径单一，主要用作饲料、肥料、燃料等廉价原料，少量在面包、调味料等方面得以开发利用[3].由于苏麻饼粕富含优质蛋白，近年来受到业界青睐：李荣等[4]利用微波辅助分步酶解紫苏饼粕，制备出高品质、高产率、高水解度及低成本的紫苏鲜味肽；徐世涛等[5]采用不同酶解方法制备的苏麻饼粕多肽，滋味、口感良好，营养价值高；盛彩虹等[6]采用酸性乙醇-水溶剂法脱除紫苏粕中植酸、单宁等物质后，用碱性蛋白酶酶解紫苏粕，制得的紫苏肽含量达63.03%，其中相对分子质量小于1000的组分占85.3%.另有学者[7-8]研究发现，苏麻多肽具有较好的抗氧化活性.

微生物发酵法具有将产酶与酶解合二为一的特点,且制备的多肽苦味较弱，故逐渐成为研究热点.研究者[9]发现，固态发酵谷物粉可获得具有抗氧化能力的多肽；此外，通过固态发酵芝麻粕和核桃粕得到的多肽抗氧化能力很强[10-11].黄永锋等[12]研究发现，通过米曲霉单菌发酵豆粕可制备大豆肽，米曲霉在发酵中主要产生中性蛋白酶[13].目前，苏麻多肽的研究大多采用酶解法，固态发酵苏麻饼粕制备多肽的研究鲜见报道.

本研究拟以米曲霉AS3.863 (AspergillusoryzaeAS3.863) 为菌种，通过单因素试验和响应面法优化固态发酵制备苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的工艺，并测定其多肽含量及1, 1-二苯基-2-苦基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率，以提高苏麻饼粕的经济价值，为高效利用苏麻籽副产物的植物蛋白资源及苏麻饼粕的深加工提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏麻饼粕，贵州省油菜研究所提供；米曲霉 AS3.863(AspergillusoryzaeAS3.863)，购于广东省微生物菌种保藏中心；DPPH，东京化成工业株式会社产；牛血清白蛋白，索莱宝科技有限公司产；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，上海博微生物科技有限公司产；三氯乙酸，上海麦克林生化科技有限公司产；NaOH、酒石酸钾钠、五水硫酸铜，均为分析纯，成都金山化学试剂有限公司产.

1.2 主要仪器与设备

DMEX20型显微镜，宁波舜宇仪器有限公司产；QE-300型高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司产；SJ-CJ-2FD型超净工作台，苏洁医疗器械(苏州)有限公司产；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司产；LRH系列生化培养箱，上海一恒科技有限公司产；PR124ZH/E型电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司产；TD5MD型台式低速离心机，长沙迈佳森仪器设备有限公司产；HJ-6B型双数显恒温磁力搅拌器，金坛区西城新瑞仪器厂产；101-2A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产；CTFD-12S 型真空冷冻干燥机，青岛永合创信电子科技有限公司产；SpectraMAX190 型酶标仪，美国 Molecular Devices 公司产.

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化及孢子悬浮液的制备首先按菌种说明书活化所购米曲霉，将活化后的菌种置于28 ℃生化培养箱中，培养至孢子成熟铺满斜面后，用无菌水将孢子洗涤倒入无菌三角瓶中；然后用灭菌后的脱脂纱布滤去菌丝片段，制得孢子悬浮液；最后用血球计数板计数后，调节孢子浓度至2×106～5×106CFU/mL，置于4 ℃冰箱备用.

1.3.2 固态发酵取20 g脱脂粉碎后过40目筛的苏麻饼粕粉加入250 mL三角瓶中，再加入适量蒸馏水用无菌玻璃棒搅拌均匀，封口后于121 ℃条件下灭菌20 min，在超净工作台按接种量(2.5%～12.5%)接入孢子悬浮液并用无菌玻璃棒搅拌均匀，在实验设计条件下进行发酵.发酵完毕后将样品取出，于121 ℃条件下灭菌10 min，在50 ℃条件下干燥48 h，即得苏麻饼粕抗氧化肽粗提物，将其粉碎后，于低温密封保存备用.

1.3.3 单因素试验设计1)发酵时间.在发酵温度28 ℃、接种量2.5%及液料比(V(蒸馏水)∶m(苏麻饼粕))1∶1条件下，考查发酵时间(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h)对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响.

2)发酵温度.在发酵时间48 h、接种量2.5%及液料比1∶1条件下，考查发酵温度(25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃)对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响.

3)接种量.在发酵时间48 h、发酵温度28 ℃及液料比1∶1条件下，考查接种量(2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%)对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响.

4)液料比.在发酵时间48 h、发酵温度28 ℃及接种量5.0%条件下，考查液料比(0.6∶1、0.8∶1、1∶1、1.2∶1、1.4∶1)对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响.

1.3.4 响应面试验设计应用 Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验确定的最佳因素水平基础上进行四因素三水平响应面试验.选择发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、液料比(D)为自变量，以苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量(Y1)和DPPH自由基清除率(Y2)为响应值，采用 Design Expert V 8.0.6 软件进行响应面试验，各因素及水平见表1.

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 The factors and levels Table of response surface test

1.3.5 多肽含量的测定采用秦卫东等[14]的方法，其中多肽含量以酸可溶性多肽含量计.取4 g苏麻饼粕抗氧化肽粗提物样品 (精确至0.000 1 g)加入40 mL蒸馏水中，磁力搅拌30 min，于4000 r/min条件下离心10 min，取一定体积上清液加入等体积的体积分数为10%的三氯乙酸溶液，混匀后于4000 r/min条件下离心10 min，去除酸不溶性蛋白和长链肽沉淀.取1 mL上清液，加4 mL双缩脲试剂混匀，避光静置30 min后，于540 nm波长处测其吸光度，空白为蒸馏水.以牛血清白蛋白为标准品，配制成质量浓度为0 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的标准溶液，并绘制标准曲线.

多肽含量按照下式计算：

式中，c为上清液中多肽的质量浓度/(mg·mL-1)，v为溶解样品提取多肽所用蒸馏水体积/mL，m为原料发酵后称取测定的样品质量/g.

1.3.6DPPH自由基清除率的测定参考N.Chen等[15]的方法，并稍作修改.取4 g苏麻饼粕抗氧化肽粗提物样品 (精确至0.000 1 g) 加入40 mL蒸馏水中，磁力搅拌30 min，于4000 r/min条件下离心10 min，取离心后上清液进行20倍稀释作为待测样液.分别吸取1.0 mL待测样液和1.0 mL 浓度为0.1 mmol/L的DPPH-无水乙醇溶液于试管中，涡旋混匀后，室温下避光反应30 min，在517 nm波长处测其吸光度，并用无水乙醇调零.以待测样品溶液和无水乙醇混合后的吸光度为对照组.DPPH-无水乙醇溶液和超纯水混合后的吸光度为空白组.DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中，A1为样品组的吸光度,A2为对照组的吸光度,A3为空白组的吸光度.

IC50表示DPPH自由基清除率为50%时抗氧化肽的质量浓度/(mg·mL-1).调整苏麻饼粕抗氧化肽的质量浓度，分别测其DPPH自由基清除率，选取DPPH自由基清除率在25%～85%范围的苏麻饼粕抗氧化肽质量浓度，再与DPPH自由基清除率通过Origin 2018软件进行线性拟合，即可求得IC50值.

1.3.7 统计学分析所有实验均重复 3 次，以SPSS 26.0进行数据统计和方差分析，以Origin 2018 作图.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 发酵时间发酵时间对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响如图1所示.由图1可看出，米曲霉固态发酵苏麻饼粕的发酵产物多肽含量随发酵时间的延长呈先增加后降低趋势.当发酵时间为48 h时，多肽含量达最高值(44.65±0.74) mg/g；之后，多肽含量随发酵时间的延长而降低.这可能是因为继续发酵产生了一些降解肽的酶类，导致多肽含量降低.发酵产物中的多肽对 DPPH 自由基的清除能力随发酵时间的延长呈先增强后减弱趋势.当发酵时间为36 h时，DPPH自由基清除率达到最高值(84.76±1.05)%，当发酵时间为48 h，为(83.84±0.95)%；之后，DPPH 自由基清除率随发酵时间的延长开始下降.综合考虑，选择48 h作为最佳发酵时间进行下一步试验.

图1 发酵时间对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of fermentation time on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.2 发酵温度发酵温度对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响如图2所示.由图2可看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均随发酵温度的升高呈先增加后降低趋势.当发酵温度为28 ℃时，多肽含量及DPPH自由基清除率均达到最高值，分别为(49.81±1.65) mg/g和(77.66±0.96)%.这是因为该米曲霉的最适生长温度是28 ℃，温度过高或过低都会影响菌株的生长代谢与酶活性.因此，选择28 ℃作为最佳发酵温度进行下一步试验.

图2 发酵温度对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.3 接种量接种量对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响如图3所示.由图3可以看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均随接种量的增加呈先增加后降低趋势.当接种量为5.0%时，多肽含量及DPPH自由基清除率均达到最大值，分别为(36.83±0.43) mg/g和(85.5±0.71)%.这是因为接种量的大小决定了米曲霉在发酵过程中的生长繁殖速度：接种量过大会导致供氧不足，影响产物合成；接种量过小则不能充分利用饼粕蛋白产多肽，发酵时间越长，发酵效率越低.该结论与W.X.Wu等[16]的研究结果一致.因此，选择5.0%作为最佳接种量进行下一步试验.

图3 接种量对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.4 液料比液料比对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影响如图4所示.由图4可以看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均随液料比的增加呈先增加后降低趋势.当液料比为1∶1时，多肽含量达到最大值(38.33±1.04) mg/g，并显著高于其他组(P<0.05).这可能是因为当水分含量较低时，不利于固态发酵基质中米曲霉的生长，菌体代谢速率降低，从而影响多肽产量；随着水分含量的增加，米曲霉能充分利用固态培养基中的水分和营养物质，从而具有更好的发酵产多肽效果；但当水分含量过高时，会导致固态发酵培养基的透气性差，不利于米曲霉的繁殖及产酶，还可能积累对米曲霉生长不利的物质.因此，选择1∶1 作为最佳液料比进行下一步试验.

图4 液料比对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of liquid-to-battery ratio on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.2 响应面优化试验结果分析

2.2.1 响应面优化试验结果及回归方程方差分析响应面优化实验设计与结果见表2.利用Design Expert v 8.0.6软件对表2数据进行二次多项式回归拟合，得到各因素与多肽含量、DPPH自由基清除率的二次回归方程如下：

表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

Y1=59.18+2.71A-0.74B+0.82C+

1.84D-0.45AB+0.25AC+0.36AD-

0.030BC+0.002 5BD-0.21CD-12.65A2-

3.58B2-0.67C2-4.27D2

Y2=82.18-1.57A+2.58B+0.32C-

2.01D-0.22AB-0.86AC+0.58AD+

0.002 5BC+0.020BD-0.023CD-

0.67A2-4.97B2-1.50C2-1.76D2

多肽含量回归模型显著性检验及方差分析见表3.由表3可知，多肽含量的二次多项式拟合模型F值为14.95，P<0.000 1，表明此回归模型极显著；失拟项检验P值为0.085(P>0.05)，失拟项不显著，表明模型可信度较高，此试验方法可靠性强.其中，一次项A与二次项A2、B2、D2对多肽含量的影响极显著，一次项D影响显著，交互项均不显著.多肽含量回归模型的相关系数R2=0.937 3，大于0.9，表明模型对试验拟合度良好，较好地反映了多肽含量与发酵时间、发酵温度、接种量、液料比的关系.结合P值及F值可知，发酵时间对苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的多肽含量影响最大，其次是液料比和接种量，发酵温度影响最小.

表3 多肽含量回归模型显著性检验及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of the regression model of peptide content

表4 DPPH自由基清除率回归模型显著性检验及方差分析Table 4 Significance test and variance analysis of the regression model of DPPH free radical scavenging rate

2.2.2 响应面分析响应面图可以较准确地展示响应值与试验参数水平之间的关系.响应面图的坡度越陡，表示指标的变化对响应值影响越大；反之，若响应面的坡度越缓，则表示该指标的变化对响应值影响越小[17].

1)苏麻饼粕抗氧化肽粗提物多肽含量的响应面分析.为考查交互项对苏麻饼粕发酵抗氧化肽粗提物多肽含量的影响，在固定2个因素不变的条件下，对模型进行降维分析.各因素交互作用对多肽含量影响的响应曲面图如图5所示.由图5可以看出，多肽含量先随各因素的增大而增大；当增大到极值后，多肽含量又随因素的增大而逐渐减小.与单因素试验结果一致.

图5 各因素交互作用对多肽含量影响的响应曲面图Fig.5 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on the content of peptides

2)苏麻饼粕抗氧化肽粗提物DPPH自由基清除率的响应面分析.各因素交互作用对DPPH自由基清除率影响的响应面图如图6所示.由图6可以看出，在固定发酵温度与液料比的条件下，苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除率先随发酵时间与接种量的增加而升高，并在一定条件下达到峰值，之后随发酵时间与接种量的增加而减少，这表明并非发酵时间越长，接种量越高，抗氧化肽的抗氧化活性越强.在实际加工生产中，要在最合适的发酵时间选择最优的接种量进行发酵，才能得到抗氧化活性最佳的苏麻饼粕抗氧化肽.

图6 各因素交互作用对DPPH自由基清除率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on DPPH free radical scavenging rate

综上所述，米曲霉固态发酵苏麻饼粕产抗氧化肽的最佳工艺条件为:发酵时间47.87 h，发酵温度28.44 ℃，接种量5.56%，液料比0.98∶1.在此工艺条件下，预测多肽含量和DPPH自由基清除率分别为(58.89±0.14) mg/g和(82.65±1.31)%.

2.3 验证实验结果分析

以2.2确定的最佳工艺进行验证实验，每份样品制作3份，每个指标测3次，结果取平均值.根据实际生产将工艺条件调整为发酵时间48 h，发酵温度 28 ℃，接种量5.5%，液料比1∶1，得到米曲霉固态发酵苏麻饼粕的多肽含量为(58.75±1.12) mg/g，比发酵前增加了2.66倍；DPPH自由基清除率为(82.13±1.54)%，比发酵前增加了0.23倍.实际结果与预测值差异均不显著(P>0.05)，表明通过响应面设计米曲霉固态发酵苏麻饼粕产抗氧化肽可靠稳定，可作为后续实践的理论支撑.

2.4 苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除能力

苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除率如图7所示.由图7可看出，苏麻饼粕抗氧化肽粗提物质量浓度与DPPH自由基清除率之间呈线性关系，通过拟合方程计算得到DPPH自由基IC50为0.17 mg/mL.R.He等[18]利用枯草芽孢杆菌固态发酵菜籽粕制备的菜籽肽DPPH自由基IC50为165 μg/mL；邢瀚文等[19]利用枯草芽孢杆菌固态发酵罗非鱼鱼皮制备的胶原蛋白肽DPPH自由基IC50为2.37 mg/mL；王海燕等[20]利用米曲霉固态发酵制曲结合成曲水解制备的大豆抗氧化肽DPPH自由基的IC50为0.29 mg/mL.本研究所得苏麻饼粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基IC50值低于胶原蛋白肽和大豆肽，与菜籽肽相似，具有较高的研究价值.

图7 苏麻饼粕抗氧化肽的DPPH自由基清除率Fig.7 The DPPH free radicals scavenging rate of the anti-oxidant peptides from the Perilla seed meal

3 结论

本文以米曲霉为发酵菌株，采用固态发酵方法制备了苏麻饼粕抗氧化肽粗提物，对影响米曲霉固态发酵苏麻饼粕产抗氧化肽的发酵时间、发酵温度、接种量、液料比4个因素进行了单因素试验，并在此基础上进行了响应面优化，得到最佳固态发酵工艺条件为：发酵时间48 h，发酵温度28 ℃，接种量5.5%，液料比1∶1.在该条件下，苏麻饼粕发酵产物的多肽含量为(58.75±1.12)mg/g，比发酵前增加了2.66倍，DPPH自由基清除率为(82.13±1.54)%，比发酵前增加了0.23倍，DPPH自由基IC50为0.17 mg/mL.本文为微生物固态发酵苏麻饼粕产抗氧化肽等相关研究提供了数据支撑和依据，但本文仅在实验室环境下进行了少量研究，后续将进一步研究大批量苏麻饼粕的固态发酵，从而为其工业化生产提供参考；另外，苏麻饼粕抗氧化多肽是一种天然活性肽，有待进一步分离纯化，并需对其生物活性进行深入研究.